1、肿瘤转移关键酶作者：李燕杰， 李吉学，彭清忠，汤国营， 林艳丽， 郭瑞锋，朱厚础【关键词】 ,肝素裂合酶Cloning of fulllength heparanase gene and expression of functional heparanase in mammalian cells【Abstract】 AIM: To explore the expression character of heparanase by isolating the full encoded gene and expressing the functional enzyme in mammalian c
2、ells. METHODS: We isolated the full encoded heparanase gene from human placenta cDNA library, cloned the gene into eukarytic expression vector pCDNA4/MycHis, transfected it into COS7 cells and CHO cells and then screened the CHO cells which permanently expressed heparanase in the selected medium. RE
3、SULTS: The activity of heparanase in the mammalian cell lysate detected was much higher than that in the culture medium. The molecular mass of the heparanase protein expressed in the transfected COS7 and CHO cells was about 53103 (Mr) by western blot. CONCLUSION: The fulllength heparanase gene is is
4、olated. The functional heparanase is expressed within COS7 and CHO cells and few heparanse is secreted into medium. The positive CHO cells expressing active heparanase is screened, which will help explore its function and screen its antibody and antagonists from a variety of sources.【Keywords】 hepar
5、in lyase; gene expression; COS7 cells; CHO cells【摘要】 目的： 分离出乙酰肝素酶(heparanase, HPA)全长编码基因并在哺乳动物细胞中表达出有活性的 HPA；探索此酶在哺乳动物细胞中的表达特性；并建立稳定表达该酶的细胞株. 方法：通过PCR 法从人胎盘 cDNA 文库中扩增 HPA 蛋白全长编码基因；构建真核表达载体，转化 COS7 细胞进行瞬时表达；分析 HPA 蛋白的活性和表达特性；转化入 CHO 细胞以筛选恒定表达 该酶的细胞株. 结果：分离扩增出 1629 bp 的人 HPA 全长 cDNA 序列并构建了其真核表达载体；在转染
6、后的 COS7 细胞和筛选出的 CHO 细胞裂解液中检测到较高的 HPA 活性和相对分子质量(Mr)大小约 53103 的目的蛋白免疫印迹表达带. 结论：本研究分离出人 HPA 编码基因全序列；在真核细胞内成功表达出有活性的人 HPA，发现此酶 在 COS7 和 CHO 细胞中表达在细胞内，很少分泌到细胞外；筛选出其恒定表达细胞株，为进一步研究 HPA 结构功能、开发其抗体及抑制 剂提供了有力的工具. 【关键词】 肝素裂合酶；基因表达；COS7 细胞；CHO 细胞0 引言乙酰肝素酶（heparanase, HPA）是一种内源性 葡萄糖醛酸酯酶，识别硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulf
7、ate proteoglycan，HSPG）的多糖侧链硫酸肝素链（heparan sulfate, HS）的特异结构，并将其降解为 1020 个糖单位大小的短糖链1 ，该酶破坏细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁2，在肿瘤转移过程中起重要作用3,4. HPA 是迄今发现的唯一的作用于细胞外基质多聚糖成分的酶，为我们提供了一个抗肿瘤转移的新药物靶点. 得到 编码 HPA 蛋白的全基因，构建、筛选有效的蛋白表达载体和细胞株，是进一步研究人 HPA 功能特性，以及研发抗 HPA 药物等的重要基础和前提. 我们拟分离出 HPA 编码基因的全序列，在真核细胞中表达完整并
8、具有活性的 HPA 蛋白，探索此 酶在哺乳动物细胞中的表达特性，并筛选恒定表达完整 HPA 蛋白的 CHO 细胞株，为进一步的研究提供基础. 1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌 TOP10 感受态细胞购自 Invitrogen 公司； COS7，CHO 细胞株由军事医学科学院生物工程研究所保存； pGEMT 载体由军事医学科学院生物工程研究所保存；真核表达载体pCDNA4/MycHis 购自 Invitrogen 公司；人胎盘 cDNA 文库购自Clontech 公司. 总 RNA 提取试剂盒（SV Total RNA Isolation System），反转录试剂盒（ImPromIITM R
9、everse Transcription System），质粒提取试剂盒均购自 Promega 公司；凝胶回收纯化试剂盒购自 Qiagen 公司；Heparan Deagrading Enzyme Assay Kit 购自日本 TAKARA 公司. 限制性内切酶 Pst， Xho， T4 DNA 连接 酶，PCR 扩增所用试剂为TAKARA 公司产品；培养基 RPMI 1640 ，胎牛血清，Zeocin ，脂质体LIPOFECTAMINE 2000 购自 Invitrogen 公司；mouse AnticMyc Antibody 和 AntiMouse IgGHRP 购自 Invitrogen
10、 公司. 1.2 方法1.2.1 分离乙酰肝素酶蛋白编码基因及测序鉴定上游引物ATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT，下游引物TCAGATGCAAGCAGCA ACTTTGGCAT，由塞百盛公司合成. 以人胎盘 cDNA 文库为模板，进行 PCR. PCR 条件 为：94 3 min，变性进入循环；94 30 s， 56 30 s, 72 30 s，30 个循环后 72继续延伸 5 min. 8 g/L 琼脂糖凝胶 电泳鉴定 PCR 产物后采用 Promega 公司的回收试剂盒纯化 PCR 产物，直接克隆入 pGEMT 载体，送联合基因公司测定基因序列. 1.2.2 构建乙酰肝素
11、酶真核表达载体 pCDNA4/MycHisHPA 使用含有 PstI 和 XhoI 酶切位点的引物CTGCAGATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT， CTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGCAT 扩增乙酰肝素酶cDNA 片段，将此片段和真核表达载体 pCDNA4/MycHis 分别用Pst和 Xho进行酶 切消化，切胶回收，于 16连接过夜，转化TOP10 感受态细胞. 挑取阳性克隆提取 质粒，用 酶切和测序法鉴定目的基因. 1.2.3 转染 COS7 细胞采用脂质体法转染，具体方法如下： 培养细胞生长到 90%95%汇合时，将 50 L无血清 DMEM 培
12、养基与 0.8 g pCDNA4/MycHisHPA 质粒混合, 50 L 无血清 DMEM 培养基与2.5 L脂质体混合，室温下孵育 5 min，然后将以上二者混合，室温下孵育 20 min. 待脂质体和 质粒的混合微粒形成，将此混合液接种于培养孔内，轻摇培养板，混匀. 在 37 ， 50 mL/L CO2 条件下的培养箱培养. 72 h 后收集细胞用于检测. 1.2.4 筛选阳性细胞株 Zeocin 的敏感浓度测定： CHO 细胞培养至 80%汇合，以每孔 2000 个细胞接种培养板； 细胞贴壁后，加入Zeocin，使每行孔内 Zeocin 的终浓度分别为 0，10，20，30，40 和
13、50 mg/L；继续培养 80 h，期间每 10 h 计算培养孔中的细胞数. 作出生长曲线，以抑制细胞生长浓度的一半为最低敏感浓度，筛选浓度定为敏感浓度的 2 倍. 使用 Zeocin 筛选阳性细胞株： pCDNA4/MycHisHPA 质粒转染 CHO 细胞，方法同上 . 48 h 后传代细胞. 继续培养细胞直到细胞贴壁，使细胞生长密度不超过 25%汇合度，倒出培养基，加入含有筛选浓度 Zeocin 的选择 培养基继续培养；18 h后，将细胞以 3103/ cm2 的密度传代至选择培养基中，每 4 日换选择培养基 1 次；然后采用有限稀释法进行单克隆筛选. 将阳性集落转移到含有选择培养基的
14、24 孔组织培养板继续培养，当孔中的细胞长到80%汇 合度，转移到 6 cm2 组织培养皿中，用选择培养基扩大培养，传代后，按常规法冻存. 1.2.5 阳性细胞鉴定 检测 mRNA： 收集细胞，提取细胞总RNA，进行 RTPCR，如有特异性扩增带出现则为阳性克隆. 检测表达蛋白： 用 Lowry 法测定各样品中的蛋白浓度，取等量蛋白用Western blot 方法检测融合在乙酰肝素酶蛋白 C 末端的 cMyc 标签，按常规法进行. 1.2.6 检测乙酰肝素酶活性采用 Heparan Degrading Enzyme Assay Kit 检测分析细胞 HPA 的生物活性5. 按试剂盒说明书测定标
15、准品，绘制活力标准曲线. 然后从以下样品中取等量蛋白测定乙酰肝素酶的活性：未经转染的 COS7 细胞裂解液；含空载体PCNA4/MycHis 的 COS7 细胞裂解液；含载 体 PCNA4/MycHisHPA的 COS7 细胞培养液；含 载体 PCNA4/MycHis HPA 的 COS7 细胞裂解液；未经转染的 CHO 细胞裂解液；含空载 体 PCNA4/MycHis 的CHO 细胞裂解液；含载 体 PCNA4/MycHisHPA 的阳性 CHO 细胞培养液；含载体 PCNA4/MycHis HPA 的阳性 CHO 细胞裂解液. 2 结果2.1 人乙酰肝素酶基因的分离扩增与鉴定 PCR 扩增
16、产物在 8 g/L 琼脂糖凝胶电泳胶上呈 单一特异性条带 （Fig 1）. 经序列测定和比较，此基因为人 HPA 全长编码基因. 2.2HPA 真核表达载体的构建与鉴定提取阳性质粒PCNA4/MycHisHPA，用 Pst， Xho酶切鉴定，在 5.1 kb 和 1.6 kb处有两条电泳带，与预期结果相符（Fig 2）. 将阳性重组子送测序公司测序，阅读框架正确，无移码，序列没有突 变，可以进行表达.2.3COS7 细胞中乙酰肝素酶蛋白的检测转染后 48 h 收集细胞，对细胞裂解液和培养基进行 Western blot 检测，发现细胞裂解液中可见一免疫印迹条带，Mr 约为 53103，在培养基
17、中未 检测到免疫印迹条带（Fig 3）.2.4Zeocin 的最低敏感度在 zeocin 的培养基中，抑制细胞生长一半的浓度为 25 mg/L，定 为最低敏感浓度， 筛选浓度为敏感浓度的2 倍：50 mg/L. 细胞的生长曲线见 Fig 4.2.5CHO 细胞中 HPA mRNA 和蛋白的检测筛选出的 4 个阳性细胞集落扩大培养后，收集细胞，提取细胞总 mRNA，反转录合成cDNA. 以 cDNA 作为模板，以相应引物进 行 PCR 扩增， PCR 扩增产物在 8 g/L 琼脂糖凝胶上呈单一特异性电泳条带，大小为 1.6 kb，与预期一致(Fig 5). 在 4 株阳性细胞中均可检测到特异的蛋
18、白免疫印迹条带(Fig 6). 2.6HPA 活性测定在转染了 PCNA4/MycHisHPA 的细胞裂解液中检测到较高的乙酰肝素酶的活性，分别为14.37，12.75，13.30，12.55 和 14.27 nkat；在未转染或转染空载体的细胞裂解液及转染了 PCNA4/MycHisHPA 的细胞培养液中的酶活性很低，分别为 0.60，0.87，0.93，0.54，0.52 和 1.45 nkat（Fig 7）. 由此认为转染了 HPA 基因的 COS7 细胞和筛选出的 CHO 阳性细胞株均表达有活性的 HPA 蛋白，且大部分有活性的 HPA 定位于细胞内. 在细胞培养液中检测到的 HPA
19、活性远远弱于细胞内，提示 HPA 没有或很少被 COS7 和 CHO 细胞分泌到细胞外. 3 讨论本研究选用胎盘 cDNA 文库为模板，首次在国内分离出人 HPA编码基因全序列. 将全 长基因克隆入真核表达载体，在哺乳动物细胞中表达出有活性的 HPA 蛋白. 在检测 HPA 在哺乳动物细胞中的表达特性时发现：检测细胞中此酶的 mRNA 长度为 1.6 kb，显示细胞完整转录了 HPA 全长编码基因，可以翻译出完整的 HPA 蛋白. 而对细胞裂解液蛋白的 Western blot 分析显示，蛋白 Mr 为 53103，小于完整蛋白的分子质量. 分析此差异认为：在细胞中全长编码基因被翻译成 Mr
20、为 61.5103 的多肽，此多肽在随后的加工的 过程中被切割，其N 端的信号肽、小亚基被未知的蛋白水解酶 切除6，余下的 C 端50103 大亚 基与载体上的 Myc 表位肽标签 蛋白融合，Mr 的总和53103. 用 Myc 抗体检测到的免疫印迹条带为此融合蛋白. 而其 N端的多肽没有与标签蛋白连接，不能被检测到. 此结果进一步验证了HPA 在蛋白水平被加工而成为有活性的酶这 一成熟过程. 另外，本研究 还发现，在细胞裂解液中检测到了大量的 HPA 蛋白，表明 HPA 蛋白在细胞中大部分定位于细 胞内. 为探索此酶是否被分泌到细胞外，我们对细胞培养液中的蛋白进行免疫印迹检测，没有发现条带.
21、 随后，我们又对各样本 HPA 的活性进行了检测，发现在细胞培养液中检测到的 HPA 活性远远弱于 细胞内，活性检测结果与免疫印迹结果相一致. 提示 HPA 大部分定位于 COS7 和 CHO 细胞内，没有或很少被分泌到细胞外. 此结果与 Orit Goldshmidt 的研究相符7. 提示 HPA 在生理条件下位于 细胞内，其表达和分泌受到严格的调控，以免其过度表达分泌对细胞外 HSPG 错误切割而造成组织损伤，发生各种病变. 而在肿瘤细胞中，不 仅其表达水平增加而且其调控机制发生紊乱，HPA 被大量分泌到细胞外基 质中从而促进肿瘤细胞转移，此机制需进一步深入研究. 【参考文献】1 Pika
22、s DS, Li JP, Vlodavsky I, et al. Substrate specificity of heparanases from human hepatoma and platelets J. Biol Chem, 1998; 273(30): 18770-18777.2 Vlodavsky I, Friedmann Y, Elkin M, et al. Mammalian heparanase: Gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis J. Nat Med, 199
23、9;5(7): 793-802.3 Elkin M, Ilan N, IshaiMichaeli R, et al. Heparanase as mediator of angiogenesis: Mode of action J. FASEB J, 2001,15(9):1661-1663.4 Vlodavsky I, Friedmann Y. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis J. J Clin Invest, 2001;108(8):341-34
24、7.5 Behzad F, Brenchley PE. A multiwell format assay for heparanase J. Anal Biochem, 2003;320(2): 207-213.6 Fairbanks MB, Mildner AM, Leone JW, et al. Processing of the human heparanase precursor and evidence that the active enzyme is a heterodimer J. J Biol Chem, 1999;274(42): 29587-29590.7 Goldshmidt O, Nadav L, Aingorn H, et al. Human heparanase is localized within lysosomes in a stable form J. Exp Cell Res, 2002;281(1): 50-62.
