1、（3） 根据蛋白质的带电性质不同进行分离 电泳根据支撑物的不同， 可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,离子交换层析法,带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质吸附于离子交换剂上，随后按吸附力大小顺序先后洗脱下来。,（4） 根据配体特异性进行分离,亲和层析法： 将配体（Ligand）分子共价结合在层析柱中的固定材料上，蛋白质混合物流经层析柱时，目标蛋白会与配体结合，之后洗脱除去杂蛋白，再用含游离配体的洗脱剂将目标蛋白替换下来。,3 蛋白质分子中氨基酸序列的确定,多肽链的分离 (+尿素，使亚基分离),二硫键的断裂 (过甲酸氧化切割法等),氨基酸组成的分析 (水合茚三酮或Edman反应),N末端残基的鉴
2、定 （Sanger法）,C末端残基的鉴定 （羧肽酶水解法）,多肽链的裂解 （成为多个小肽段）,肽段氨基酸序列的测定 （Edman降解法等）,本章小节,蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白 蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定 二十种氨基酸的结构、分类及名称 氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定 蛋白质的空间结构：二级结构单元（ -螺旋、-折叠、 -转角、自由回转）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系 蛋白质的性质：大分子
3、性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应 蛋白质的分类：按外形及组成分类,思考题：1、如何计算氨基酸的pI。 2、什么是蛋白质的一、二、三、四级结构？ 3、维持蛋白质空间结构的力有哪些？ 4、简述蛋白质结构与功能的关系？,第二章 核酸化学,Nucleic Acids,概 述,核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸RNA（Ribonuc
4、leic acid) 核糖核酸,1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时, 发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物, 并在所有细胞的核里都找到了此物质, 故命名核质(Nuclein)。,一、核酸研究简史,1879年Kossel经过10年的努力, 搞清楚核质中有四种不同的组成部分: A,T, C和G。1889年Altman建议将核质改名为“核酸”, 并且已经认识到“核质” 乃“核酸” 与蛋白质的复合体。,1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖。 1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖, 得出了一个错误概念: 植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖
5、。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖(碱基)-磷酸”的骨架结构, 解决了DNA分子的线性问题, 还在1935年提出“四核苷酸”学说, 认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。,1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。,1952年Hershey & Chase的噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质。,1950年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分, 得知A=T, G=C, A+G=C+T1953年Watson, Cri
6、ck根据DNA的X射线图谱的研究结果, 提出了DNA的双螺旋模型(Double helix)。几星期后提出了半保留式复制模型。1957年Meselson Stahl用密度梯度超离心法, 证实半保留复制假说。1958年Kornberg得到高纯度的DNA polymerase(DNA聚合酶), 这种酶需要一个模板DNA。1960年Cairns拍摄了复制中的细菌DNA的电镜照片。1970年发现第一个DNA限制性内切酶。1972年建立DNA重组技术。1978年建立DNA的双脱氧测序法。1990年开始实施人类基因组计划。1994年 中国人类基因组计划启动2003年人类基因组计划宣告完成测序任务。,二、核
7、酸的分类及分布、功能,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,3.1 核酸的分子组成,一、核酸元素组成,主要元素组成： C、H、O、N、P,与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,3.1.1 戊 糖,RNA和DNA两类核酸是因所含的戊糖不同而分类的,RNA：D-核糖，某些含有少量的D-2-O-甲基核糖DNA：D-2-脱氧核糖,在核酸中，戊糖的第一位与碱基形成糖苷键，所形成的化合物成为核苷。 核苷中戊糖的原子编号改为1 ，2 ，3 。,五碳糖的立体结构,3.1.2 碱 基（含氮碱）
8、,嘧啶和嘌呤环中各原子的编号是目前国际上普遍采用的统一编号 碱基可用英文名称前3个字母表示：Ade, Gua, Cyt, Ura, Thy亦可用英文名称第一个字母表示：A, G, C, U, T,DNA和RNA均含腺嘌呤和鸟嘌呤，但二者所含的嘧啶碱有所不同：RNA主要含胞嘧啶C和尿嘧啶UDNA则含胞嘧啶C和胸腺嘧啶T（5-甲基尿嘧啶）,胺式亚胺式互变异构,碱基的互变异构,胞嘧啶,氨基,亚氨基,酮式烯醇式互变异构,胸腺嘧啶,酮式烯醇式互变异构,生理pH条件下，主要以酮式存在,稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的衍生物。,一些核酸中还存在少量的其他修饰碱基，也称为微量碱基或稀有碱基。,碱基在细胞
9、中受到各种各样的修饰后，其产物常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用.,碱基的结构特征,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收(260 nm左右)。,3.1.3 核苷 (nucleoside),糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,核苷，是戊糖和含氮碱生成的糖苷。核糖的1 碳原子通常与嘌呤碱的第9氮原子或嘧啶碱的第1氮原子相连,顺鸟苷,反鸟苷,反尿苷,核苷常用单字母符号表示：A, G, U, C核糖核苷则在单字母符号前加一小写的d：dA, dG, dT, dC,由嘌呤形成的核苷有顺式和反式两种结构类型。 嘧啶形成的核苷只有反式构象
10、是稳定的。,3.1.4 核苷酸(ribonucleotide),（1）核苷酸的结构与功能,核苷和磷酸以磷酸酯键连接,核苷酸是核苷的磷酸酯,核苷酸中的核糖有3个自由的羟基 2 -，3 -，5 -核苷酸脱氧核苷酸的核糖上只有2个自由羟基 3 -，5 -脱氧核苷酸生物体内的游离核苷酸多为5 -核苷酸，因此通常将核苷- 5 -磷酸简称为核苷酸,核苷酸通常用英文缩写表示：腺苷酸：AMP鸟苷酸：GMP 脱氧核苷酸表示：dAMP, dGMP,脱氧核苷酸,核苷酸,酶水解DNA或RNA，除得到5 -核苷酸外，还可得到3 -核苷酸。,在核苷酸符号左侧加小写p表示,在核苷酸符号右侧加小写p表示,如：pA表示5 -腺
11、苷酸Cp表示3 -胞苷酸若为2 -磷酸酯，则需标明如： 表示2 -鸟苷酸,生物体内的腺苷酸AMP可与1分子磷酸结合，生成腺苷二磷酸（ADP），ADP再与1分子磷酸结合，生成腺苷三磷酸（ATP）。,各种核苷三磷酸（ATP，GTP，CTP，UTP）是体内RNA合成的直接材料。 各种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）是体内DNA合成的直接材料。,核苷三磷酸化合物在生物体的能量代谢中 起着重要作用。,UTP参与糖的转化与合成 CTP参与磷脂的合成 GTP参与蛋白的合成,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 ATP 是生
12、物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。 ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,环化核苷酸cAMP和cGMP,cAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。 cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol，比ATP水解能高得多。,3 ，5 -环腺苷酸,3 ，5 -环鸟苷酸,腺苷酸是一些辅酶的结构成分,烟酰胺腺嘌呤
13、二核苷酸 （辅酶）,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （辅酶）,（1）核苷酸的性质,核苷酸的碱基含有共轭双键结构，故核苷酸在紫外区(260 nm左右)有强吸收峰。 紫外吸收受碱基种类和解离状态的影响。,利用碱基紫外吸收的差别可以鉴定各种核苷酸,当pH处于第一磷酸基和碱基环解离曲线的交点时，二者解离度相等，第二磷酸基尚未解离，这一pH为该核苷酸的等电点。,当pH小于等电点时，整个核苷酸带正电荷 当pH大于等电点时，整个核苷酸带负电荷,3.2 核酸的一级结构,DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链，链中每个核苷酸的3-羟基和相邻核苷酸戊糖上的 5-磷酸相连。,末端： 5 端、 3端 链的方向： 5端3端
14、 侧链：碱基 主链：由相间排列的戊糖和磷酸构成,1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键,2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链,一级结构（primary structure）是指各核苷酸残基沿多核苷酸链的排列顺序。 核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,由于戊糖和磷酸是不断重复的，也可以用碱基序列表示核酸的一级结构。,一级结构的书写：p表示磷酸基团，放在核苷符号的左侧，表示磷酸与糖环的5 -羟基结合，右侧表示与3 -羟基结合,核酸酶的水解部位表示：pApCp GpU 表示水解后C的3 -羟基连有磷酸基，G的5 -羟基是游离的。,pApC pGpU ？,p,3.3 DNA的二级结构,DNA双链的螺旋
15、形空间结构称DNA的二级结构,DNA的碱基成对的证据 查加夫规则（Chargaff 规则）：数目基本相等腺嘌呤A = 胸腺嘧啶T 2个氢键鸟嘌呤G 胞嘧啶 C 3个氢键,DNA的滴定曲线DNA形成双链，有关基团参与了氢键的形成当6pH9时，单链的DNA才能形成双链,DNA纤维的X-线衍射图谱分析表明DNA含有两条或两条以上的具有螺旋 结构的多核苷酸链,3.3.1 DNA双螺旋结构的实验依据,DNA分子由两条DNA单链组成。 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构的特点,double helix mode
16、l,3.3.2 DNA双螺旋结构模型的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。,（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与螺旋轴基本平行。,（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。构成碱基对的两个碱基平面间有螺旋桨式扭曲。,DNA分子的大小常用碱基对数（bp）
17、表示，单链分子的大小常用碱基数（b）来表示,（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:一条链上的A与另一条链的T结合，G与C结合，这种互补关系，称为碱基配对。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,胸腺嘧啶,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,DNA中的碱基对,（5）由于碱基对并不处于两条主链的中间，螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。（6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定
18、性。,（7）大多数天然DNA属双链DNA，某些病毒为单链DNA。（8）DNA分子主链上的化学键由于碱基配对的影响旋转受到限制，DNA分子比较刚硬，呈比较伸展的结构；一些化学键可在一定范围内旋转，又使DNA分子有一定的柔韧性。,DNA链中有不少单键可以旋转，因此DNA在一定的条件下会呈现不同的结构类型。,3.3.3 DNA二级结构的其他类型,DNA的二重对称结构即一条链碱基序列的正读与另一条链碱基序列的反读是相同的。,DNA的镜像重复结构,DNA的三螺旋结构,3.4 DNA的高级结构,DNA的三级结构,双螺旋进一步扭曲，形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重
19、螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等。,松弛环形DNA,超螺旋,解链环形DNA,生物体内绝大多数双链环形DNA可进一步扭曲成超螺旋DNA（或称共价闭环DNA）,一条链断裂,正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与双螺旋方向相反,松弛环形,负超螺旋,解链环形,bp:400 L:40 T:40 W:0,bp:400 L:36 T:36 W:0,bp:400 L:36 T:40 W:-4,L=T+W, 其中L为定值且为整数,DNA中一条链绕另一条链的总次数连环数L双螺旋的圈数扭转数T超螺旋数缠绕数W,在生物体内，绝大多数环形DNA以负超螺旋的形式存在,3.4.2 真核生物染色体的结构,核小体(nucleosome)： 双螺旋DNA分子盘绕组蛋白形成。,DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上,组蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4,H1组蛋白在核小体之间,双螺旋DNA分子盘绕组蛋白形成念珠状的核小体，进一步盘绕成螺线管型，之后形成大的突环结构，经进一步折叠，形成微带，最后折叠形成染色体。,真核生物染色体的结构,
