1、乳糖微生物限度检查分析方法验证方案2006年 XX月验 证 方 案 起 草 审 批 表部 门 姓 名 签 名 日 期起草人 质量控制部质量控制部质量保证部审批人副 总验证方案目录1、目的2、适用范围3、接受标准4、所需仪器校验情况5、验证方法6、人员和职责乳糖微生物限度检查分析方法验证方案1 目的：建立乳糖微生物限度分析方法，包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的检查，并对分析方法进行验证，以证明所采用的方法适合于乳糖微生物限度的检查，为日常的检测工作提供依据。2 适用范围：适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。3 可接受的标准：3.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准3.
2、1.1 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。3.1.2 在 3 次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。3.2 控制菌检查验证可接受的标准3.2.1 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。3.2.2 阴性对照应无菌生产，供试品应无菌生长。4 所需仪器校验情况：应有所需仪器检定时间、检定部门及有效期。5 验证方法：5.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证（直接接种法）5.1.1 试验用的菌种：（1
3、）金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44 102（3）枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）CMCC(B)63 501（4）白色念珠菌（ Candida albicans）CMCC(F)98 001（5）黑曲霉（ Aspergillus niger）CMCC(F)98 0035.1.2 培养基及稀释液培养基：改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、 PH7.0 的无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液5.1.3 试验步骤5
4、.1.3.1 培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在 121的温度条件下灭菌 20min 冷却后备用。5.1.3.2 滤器及滤膜将试验所用的培养皿，研钵及其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，把试验用的滤器、手术镊洗净、擦干，放于带盖的容器内（瓷盒或铝制饭盒） ，盖严，用牛皮纸包裹好，将滤膜用纯化水漂洗后放入带盖的培养皿中，用牛皮纸包裹好放在高效灭菌器中，在 121的温度条件下灭菌 20 分钟冷却后备用。5.1.3.3 菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在 3035培养 1824
5、 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，在 2328培养 2448 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，在2328培养 57 天，加入 35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。5.1.3.4 供试液的制备取乳糖 10g，加入 90ml PH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解，混匀，作为 1:1
6、0 的供试液。5.1.3.5 具体操作a 试验组 用吸管分别取上述 1:10 供试液 1ml 和含试验菌 50-100CFU 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前 3 种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后 2 种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b 菌液组（测定所加的试验菌数）取和试验组一样多的试验菌加入平皿后培养。c 供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液 1ml，加入平皿中，平行操作 4 份，2 份加入营养琼脂培养基并培养，另 2 份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d 稀释剂对照组用吸管分别取稀释液 1ml 和含试验菌
7、50-100CFU 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前 3种菌营养琼脂培养基，后 2 种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。e 阴性对照用吸管分别取 PH7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 1ml 置平皿中，分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。5.1.3.6 按 5.1.3.5 独立平行操作 3 份。5.1.3.7 培养及计数分别将玫瑰红钠琼脂培养基在 2328培养 72 小时，逐日计数，以 72 小时的菌落数报告，营养琼脂培养基在 3035 培养 48 小时逐日计数，以 48 小时的菌落数报告。5.2
8、 控制菌检查的验证5.2.1 试验用的菌种（1）金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44 1025.2.2 培养基及稀释液培养基: 营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、 PH7.0 的无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液5.2.3 试验步骤5.2.3.1 培养基的配制和灭菌将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在 121
9、的条件下灭菌 20min 冷却后备用。5.2.3.2 试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在 121的温度条件下灭菌 20 分钟冷却后备用。5.2.3.3 菌液制备 接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 1824 小时。用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10100cfu 的菌悬液。5.2.3.4 供试液的制备见 5.1.3.4 供试液的制备5.2.3.5 具体操作a 试验组 分别取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液 10ml 和含试验菌 50100cfu 大肠埃希菌的菌悬液，置于盛放有 90m
10、l 胆盐乳糖培养基中。b 阴性菌对照组 分别取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液 10ml 和含试验菌 50100cfu 金黄色葡萄球菌的菌悬液，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。c 阴性对照取 PH7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 10ml，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。D 供试品的测试取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液 10ml，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。5.2.3.6 培养及计数将胆盐乳糖培养基放入培养箱中，在 35-37培养 18-24 小时，必要时延长至 48 小时计数。 6 人员和职责：XXX：负责审核验证方案和报告，组织实施验证。XX
11、X：负责验证过程中的具体操作及验证记录的完成。XXX：负责验证方案和报告的起草以及原始记录的复核。XXX：负责验证草案和验证报告的审批、验证过程的管理。XX：负责验证草案和验证报告的批准。验 证 报 告 起 草 审 批 表部 门 姓 名 签 名 日 期起草人 质量控制部审批人质量控制部质量保证部副 总验证报告目录1 目的2 适用范围3 接受标准4 所需仪器校验情况5 验证方法6 验证结果与评价7 附录乳糖微生物限度检查法分析方法的验证报告1 目的: 乳糖微生物限度检查法分析方法的验证已经完成，具体的验证结果和试验批号见下列报告。在以后的微生物限度检查中，乳糖微生物限度检查法按照验证的方法和实验
12、条件进行操作。2 适用范围：适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。3 可接受的标准：3.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准3.1.1 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。3.1.2 在 3 次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。3.2 控制菌检查验证可接受的标准3.2.1 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。3.2.2 阴性对照应无菌生产，供试品应无菌生长。4 所需仪器校验情况。
13、仪器 型号 校正时间 有效期至生化培养箱 LRH-250生化培养箱 LRH-250超净工作台 YJ-900超净工作台 YJ-1450检查人： 日期：5 验证方法：5.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证(平皿法)5.1.1 试验用的菌种:（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44 102（3）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）CMCC(B)63 501（4）白色念珠菌（ Candida albicans）CMCC(F)98 001（5）黑曲霉（ As
14、pergillus niger）CMCC(F)98 0035.1.2 培养基及稀释液培养基: 改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液, PH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.1.3 试验步骤5.1.3.1 培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在 121的条件下灭菌 20min 冷却后备用。5.1.3.2 滤器及滤膜将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在 121的温度条件下灭菌 20 分钟冷却后备用。5.1.3.3 菌液制备接种大肠埃希菌
15、、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在 3035培养 1824 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，在 2328培养 2448 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，在 2328培养 57 天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。5.1.3.4 供试液的制备a 取
16、乳糖 10g，加入 90ml PH7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液中溶解，混匀，作为1:10 的供试液。5.1.3.5 具体操作a 试验组 用吸管分别取上述 1:10 供试液 1ml 和含试验菌 50-100CFU 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前 3 种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后 2 种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b 菌液组（测定所加的试验菌数）取和试验组一样多的试验菌过滤后培养。c 供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液 1ml，加入平皿中，平行操作 4 份，2份加入营养琼脂培养基并培养，另 2
17、份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d 稀释剂对照组用吸管分别取稀释液 1ml 和含试验菌 50-100CFU 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前 3 种菌营养琼脂培养基，后 2 种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。e 阴性对照用吸管分别取 PH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 1ml 置平皿中，分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。5.1.3.6 按 5.1.3.5 独立平行操作 3 份。5.1.3.7 培养及计数分别将玫瑰红钠琼脂培养基在 2328培养 72 小时，逐日计数，以 72 小时的菌落数报告，
18、营养琼脂培养基在 3035培养 48 小时逐日计数，以48 小时的菌落数报告。5.2 控制菌检查的验证5.2.1 试验用的菌种（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44 1025.2.2 培养基及稀释液培养基: 营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、PH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.2.3 试验步骤5.2.3.1 培养基的配制和灭菌将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基
19、、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在 121的条件下灭菌 20 分钟冷却后备用。5.2.3.2 滤器及滤膜将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在 121的温度条件下灭菌 20 分钟冷却后备用。5.2.3.3 菌液制备 接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 1824 小时。用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10100cfu 的菌悬液。5.2.3.4 供试液的制备见 5.1.3.4 供试液的制备5.2.3.5 具体操作a 试验组 分别取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液
20、10ml 和含试验菌 50100cfu 大肠埃希菌的菌悬液，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。b 阴性菌对照组 分别取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液 10ml 和含试验菌 50100cfu 金黄色葡萄球菌的菌悬液，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。c 阴性对照取 PH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 10ml，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。D 供试品的测试取上述 5.1.3.4 中 1：10 供试液 10ml，置于 100ml 的胆盐乳糖培养基中。5.2.3.6 培养及计数将胆盐乳糖培养基放入培养箱中，在 35-37培养 18-24 小时，必要时延长至 48 小时
21、计数。 5.3 测定结果5.3. 1 细菌数、霉菌数及酵母菌数的验证结果营养琼脂培养基培养温度： 培养时间： 培养箱编号： 玫瑰红钠琼脂培养基培养温度： 培养时间： 培养箱编号:菌落计数（ CFU/皿）第一次 第二次 第三次试验项目 平皿1平皿2平均值平皿1平皿2平均值平皿1平皿2平均值阴性对照营养琼脂培养基供试品对照组玫瑰红钠琼脂培养基菌种及批号CMCC（B）44102(大肠埃希菌)CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)培养基名称：营养琼脂培养基CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）CMCC（F）98001（白色念珠菌）试验组培养基名称：玫瑰红钠琼脂培养基 CMCC（F）98003（黑
22、曲霉）CMCC（B）44102(大肠埃希菌)CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)培养基名称：营养琼脂培养基CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）CMCC（F）98001（白色念珠菌）菌液组 培养基名称：玫瑰红钠琼脂培养基 CMCC（F）98003（黑曲霉）CMCC（B）44102(大肠埃希菌)CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)培养基名称：营养琼脂培养基CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）稀释剂对照组 培养基名称：玫瑰红钠琼脂培CMCC（F）98001（白色念珠菌）养基 CMCC（F）98003（黑曲霉）5.3.2 回收率菌回收率菌种 组名称第 1 次 第 2 次 第 3 次
23、稀释剂对照组大肠埃希菌 试验组试验组枯草芽孢杆菌 稀释剂对照组试验组金黄色葡萄球稀释剂对照组试验组白色念珠菌稀释剂对照组试验组黑曲霉 稀释剂对照组结论：试验人： 日期：复核人： 日期：5.3.3 控制菌培养箱编号： 培养温度： 培养时间： 培养基名称：胆盐乳糖培养基试验项目 培养结果阴性对照供试品组菌种及批号试验组CMCC（B）44102(大肠埃希菌)阴性菌对照组 CMCC（B ）26003(金黄色葡萄球菌)结论：试验人： 日期：复核人： 日期：6、验证结果与评价乳糖微生物限度检测法的测定方法，在细菌数、霉菌数及酵母菌数的验证中分别用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、黑曲霉、白色念珠菌
24、五种菌种逐一进行了验证，在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均高于 70%，试验组的菌回收率均高于 70%。阴性对照为阴性，供试品对照组的检验结果在标准内。在控制菌的验证中分别用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌两种菌种进行了验证，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验菌，阴性对照无菌生产，供试品无菌生长。所以配制培养基和做样过程中要用到的用具的灭菌条件均可行，计数方法准确和控制菌方法专属性强，能满足乳糖微生物限度检查的需要，此分析方法是可行的。在以后的微生物限度检测中，检验人员按照验证的分析方法进行乳糖微生物限度检查。若药品组分或原检验条件发生了改变时，检查方法应重新验证。7、附录7.1 无菌操作规程7.2 微生物及无菌检查方法的验证操作程序7.3 后附偏差处理报告。偏 差 记 录日 期 报告人 允许偏差 参 考 描述偏差的性质 偏差对性能确认的影响 纠正措施 偏差是否满意解决 备注 记录人 日期 复核人 日期
