1、生 物 技 术 通 讯 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.24No.4 Jul.,2013 综 述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.035 体 外 诊 断 试 剂 防 腐 剂 的 选 择 策 略 黄 倩 云 ， 吴 恩 应 ， 李 慧 ， 张 佩 ， 郭 采 平 深 圳 市 卫 光 生 物 制 品 股 份 有 限 公 司 ， 广 东 深 圳 518107 摘 要 对 体 外 诊 断 试 剂 中 防 腐 剂 的 作 用 机 理 及 选 择 原 则 进 行 了 阐 述 ， 并 对 目 前 常 用 的 防 腐 剂 如 叠 氮 钠 、 庆
2、大 霉 素 、 硫 柳 汞 、 异 噻 唑 啉 酮 类 等 的 性 能 进 行 了 比 较 ， 为 体 外 诊 断 试 剂 的 研 究 开 发 及 生 产 中 防 腐 剂 的 使 用 提 供 有 益 指 导 。 关 键 词 体 外 诊 断 试 剂 ； 防 腐 剂 ； 异 噻 唑 啉 酮 中 图 分 类 号 R446.1 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 1009-0002 （2013 ） 04-0592-03 G u i d e l i n e f o r P r e s e r v a t i v e s S e l e c t i o n o f I n V i t r o D i
3、a g n o s t i c R e a g e n t HUANG Qian-Yun, WU En-Ying, LI Hui, ZHANG Pei, GUO Cai-Ping* Shenzhen Weiguang Biological Products Co., Ltd, Shenzhen 518107, China *Corresponding author, E-mail: A b s t r a c t This article described the mechanism and selection principle of preserveatives for in vitr
4、o diagnostic （IVD ）reagents. Moreover, the ordinarily used preservatives, such as sodium azide, thiomersalatum, gentamicin and isothiazolinones, were reviewed and compared. This article supplys a practical guide for preserveatives application in IVD reagents development and production. K e y w o r d
5、 s in vitro diagnostic reagent; preservative; isothiazolinones 我 国 诊 断 试 剂 市 场 规 模 为30 亿40 亿 元 ， 约 占 全 球 市 场 的1.14% ， 年 增 长 速 度 为15%20% ， 发 展 潜 力 巨 大 1 。 体 外 诊 断 试 剂 在 临 床 检 验 应 用 中 已 相 当 普 遍 ， 随 着 科 学 技 术 的 发 展 ， 体 外 诊 断 试 剂 的 种 类 越 来 越 多 ， 用 途 也 越 来 越 广 泛 。 在 体 外 诊 断 试 剂 相 关 产 品 研 发 过 程 中 ， 除 了 需
6、要 关 注 其 准 确 性 和 重 复 性 外 ， 研 发 人 员 同 样 需 要 保 证 产 品 在 保 质 期 内 的 品 质 ， 因 此 防 腐 剂 的 选 择 至 关 重 要 。 防 腐 剂 是 一 类 能 够 杀 灭 或 抑 制 微 生 物 生 长 的 化 学 物 质 ， 在 液 体 试 剂 中 发 挥 着 重 要 的 防 腐 作 用 。 只 有 充 分 了 解 各 种 防 腐 剂 的 特 性 ， 才 能 选 择 最 合 适 的 防 腐 剂 及 试 剂 配 伍 比 例 。 我 们 根 据 防 腐 剂 的 作 用 机 理 及 选 择 原 则 ， 简 述 了 叠 氮 钠 、 庆 大 霉
7、素 、 硫 柳 汞 、 异 噻 唑 啉 酮 类 等 防 腐 剂 在 体 外 诊 断 试 剂 中 的 性 能 对 比 及 应 用 范 围 ， 以 期 帮 助 科 研 人 员 更 好 地 选 择 合 适 的 防 腐 剂 。 1 防 腐 剂 的 作 用 机 理 及 一 般 选 择 原 则 防 腐 剂 是 能 够 杀 灭 或 抑 制 微 生 物 ， 特 别 是 细 菌 和 真 菌 生 长 的 化 学 物 质 。 防 腐 剂 不 是 杀 菌 剂 ， 没 有 很 强 的 即 时 杀 灭 效 果 ， 只 有 在 足 够 浓 度 并 与 微 生 物 直 接 接 触 的 情 况 下 才 能 发 挥 作 用 。
8、防 腐 剂 通 过 作 用 于 微 生 物 的 细 胞 膜 、 细 胞 壁 及 酶 等 多 个 靶 点 ， 破 坏 细 胞 的 分 裂 ， 抑 制 微 生 物 的 生 长 和 繁 殖 ， 达 到 防 腐 的 目 的 。 实 际 上 ， 防 腐 剂 主 要 是 对 酶 活 力 或 对 细 胞 原 生 质 部 分 的 遗 传 微 粒 结 构 产 生 影 响 的 。 例 如 ， 硫 柳 汞 作 用 于 巯 基 酶 ， 而 庆 大 霉 素 则 作 用 于 核 糖 体 。 总 之 ， 防 腐 剂 是 通 过 抑 制 细 胞 中 基 础 代 谢 酶 的 合 成 或 重 要 生 命 物 质 核 酸 和 蛋
9、白 质 的 合 成 ， 起 到 阻 碍 细 胞 生 长 的 作 用 。 防 腐 剂 的 种 类 很 多 ， 如 酸 碱 及 其 盐 类 、 中 性 化 合 物 类 、 汞 化 合 物 类 、 季 胺 化 合 物 类 等 。 防 腐 剂 对 微 生 物 繁 殖 体 有 杀 灭 作 用 ， 但 对 芽 孢 则 使 其 不 能 发 育 为 繁 殖 体 而 逐 渐 死 亡 。 不 同 类 型 的 防 腐 剂 其 作 用 机 理 也 不 尽 相 同 ， 如 醇 类 能 使 病 原 微 生 物 蛋 白 质 变 性 ； 苯 甲 苯 酸 、 尼 泊 金 类 等 则 能 与 病 原 微 生 物 酶 系 统 结
10、合 ， 竞 争 其 辅 酶 ； 阳 离 子 表 面 活 性 剂 等 则 是 通 过 降 低 表 面 张 力 作 用 ， 增 加 菌 体 细 胞 膜 的 通 透 性 2 。 优 良 的 防 腐 剂 应 具 备 以 下 特 性 ： 加 入 防 腐 剂 应 能 有 效 抑 制 在 试 剂 盒 制 备 、 保 存 和 使 用 过 程 中 最 有 可 能 污 染 的 一 种 或 多 种 微 生 物 的 生 长 ； 防 腐 剂 应 对 大 多 数 细 菌 、 真 菌 及 酵 母 有 较 强 的 抑 制 作 用 ； 防 腐 剂 在 试 剂 中 有 足 够 的 溶 解 度 ， 以 保 证 其 在 两 相 或
11、多 相 体 系 的 试 剂 中 具 有 足 够 浓 度 ； 在 试 剂 盒 的 有 收 稿 日 期 ： 2012-11-30 基 金 项 目 ： 广 东 省 中 国 科 学 院 全 面 战 略 合 作 项 目 “ 病 毒 感 染 重 病 救 治 特 效 抗 体 药 物 技 术 ” （2009B091300101 ） 作 者 简 介 ： 黄 倩 云 （1983- ） ， 女 ， 本 科 ， 工 程 师 通 信 作 者 ： 郭 采 平 ， （E-mail ） 592效 期 内 ， 防 腐 剂 应 非 常 稳 定 ， 不 会 因 化 学 降 解 或 挥 发 而 降 低 浓 度 ； 防 腐 剂 本
12、身 的 理 化 性 质 和 抗 微 生 物 性 质 应 稳 定 ， 不 易 受 热 和 样 品pH 值 的 影 响 ， 在 长 期 贮 存 时 不 分 解 失 效 、 不 挥 发 ， 不 沉 淀 ， 不 与 包 装 材 料 起 作 用 ； 防 腐 剂 不 与 试 剂 盒 中 的 任 何 成 分 发 生 反 应 ， 不 会 影 响 试 剂 盒 的 检 测 效 果 或 防 腐 剂 的 效 果 ； 使 用 成 本 低 ， 容 易 获 得 。 2 常 用 防 腐 剂 的 特 性 2.1 叠 氮 钠 （sodium azide ， NaN3 ） 叠 氮 钠 是 体 外 诊 断 试 剂 中 最 常 用 的
13、 防 腐 剂 之 一 ， 可 抑 制 细 菌 生 长 ， 溶 于 水 、 液 氨 ， 不 溶 于 乙 醚 ， 微 溶 于 乙 醇 ， 用 量 一 般 为0.1%0.5% 。 多 数 情 况 下 行 之 有 效 ， 但 由 于 其 含 有 氨 基 ， 会 干 扰 辣 根 过 氧 化 物 酶 （HRP ） 、 超 氧 化 物 歧 化 酶 、 触 酶 等 多 种 酶 ， 所 以 一 般 含 有HRP 的 试 剂 都 不 建 议 使 用 。 同 理 ， 一 般 不 用 于 抗 体 及 酶 免 实 验 中 的 标 本 保 存 。 另 外 ， 它 能 阻 断 细 胞 的 电 子 传 递 链 ， 对 许 多
14、 生 物 体 都 有 毒 性 ， 因 此 也 不 适 用 于 活 体 实 验 。 同 时 ， 叠 氮 钠 与 氰 化 物 相 似 ， 属 于 剧 毒 化 合 物 ， 半 数 致 死 量 为27 mg/kg （ 大 鼠 ， 经 口 ） ， 对 细 胞 色 素 氧 化 酶 和 其 他 酶 有 抑 制 作 用 ， 并 能 使 体 内 氧 合 血 红 蛋 白 形 成 受 阻 ， 有 显 著 的 降 压 作 用 。 急 性 中 毒 出 现 头 晕 、 头 痛 、 全 身 无 力 、 血 压 下 降 、 心 动 过 缓 和 昏 迷 。 除 对 眼 和 皮 肤 有 刺 激 性 外 ， 还 可 经 吸 入 、
15、 口 服 或 皮 肤 吸 收 引 起 中 毒 死 亡 ， 而 且 遇 高 热 或 剧 烈 震 动 能 强 烈 爆 炸 ， 使 用 时 应 十 分 注 意 安 全 3 。 出 于 安 全 方 面 的 考 虑 ， 叠 氮 钠 的 使 用 日 益 受 限 。 2.2 硫 柳 汞 （thiomersalatum ， C9H9O2HgNaS ） 硫 柳 汞 作 为 防 腐 剂 已 有60 多 年 历 史 ， 曾 广 泛 用 于 生 物 制 品 中 的 疫 苗 及 体 外 诊 断 试 剂 。 硫 柳 汞 稍 有 特 殊 臭 味 ， 微 有 引 湿 性 ， 遇 光 易 变 质 ， 易 溶 于 水 、 乙 醇
16、 ， 不 溶 于 乙 醚 和 苯 ， 用 量 为0.001%0.01% 。 它 对 革 兰 阳 性 和 阴 性 菌 均 有 很 强 的 抑 菌 能 力 ， 为 广 谱 抑 菌 剂 。 其 作 用 机 理 为 重 金 属 离 子 与 菌 体 中 酶 蛋 白 的 巯 基 结 合 而 使 酶 失 去 活 性 ， 但 对 细 菌 抗 原 和 血 清 蛋 白 的 损 害 极 其 微 弱 ， 不 能 与 酸 、 碘 、 铝 等 重 金 属 盐 或 生 物 碱 配 伍 。 硫 柳 汞 为 含 汞 化 学 物 质 ， 汞 含 量 占 到 分 子 质 量 的50% ， 代 谢 或 降 解 产 物 为 乙 基 汞
17、 和 硫 代 水 杨 酸 盐 ， 乙 基 汞 是 由 二 甲 基 汞 降 解 的 有 机 汞 。 由 于 少 量 有 机 汞 在 理 论 上 具 有 神 经 毒 性 4 ， 因 此 硫 柳 汞 的 使 用 安 全 问 题 深 受 人 们 关 注 。 2.3 庆 大 霉 素 （gentamicin ， C21H43N5O7 ） 庆 大 霉 素 是 由 绛 红 小 单 孢 菌 、 棘 孢 小 单 孢 菌 等 发 酵 产 生 的 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 ， 是 由22- 脱 氧 链 霉 胺 、 绛 红 糖 胺 、 加 拉 糖 胺 组 成 的 多 组 分 混 合 物 ， 并 以 C 族 复 合
18、 物 为 主 。 其 作 用 机 理 是 直 接 与30S 核 糖 体 亚 单 位16S rRNA 解 码 区 的A 部 位 结 合 ， 从 而 导 致 菌 体 死 亡 。 它 的 抗 菌 谱 较 广 ， 对 绿 脓 杆 菌 、 大 肠 杆 菌 、 产 气 杆 菌 、 克 雷 伯 杆 菌 、 奇 异 变 形 杆 菌 、 某 些 吲 哚 变 形 杆 菌 、 某 些 奈 瑟 菌 、 某 些 无 色 素 雷 杆 菌 和 志 贺 菌 等 革 兰 阴 性 菌 有 抗 菌 作 用 ， 对 革 兰 阳 性 菌 中 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 也 有 很 强 的 抗 菌 作 用 5 。 但 抗 生 素 的
19、 缺 点 是 容 易 产 生 耐 药 性 ， Jakobsen 等 6 曾 报 道 了120 株 对 庆 大 霉 素 耐 药 的 大 肠 埃 希 菌 的 最 小 抑 菌 浓 度 （MIC ） 和 耐 药 机 制 的 关 系 。 2.4 异 噻 唑 啉 酮 类 （isothiazolinones ） 异 噻 唑 啉 酮 类 防 腐 剂 商 品 化 产 品 主 要 有Kathon 和Proclin ， 是2 种 异 噻 唑 啉 酮 类 化 合 物 的 混 合 物 ， 并 含 有 一 定 量 的 硝 酸 镁 及 氯 化 镁 。 此 类 防 腐 剂 是 非 常 高 效 的 防 腐 剂 ， 对 各 种
20、细 菌 、 霉 菌 、 酵 母 及 藻 类 有 很 强 的 抑 制 作 用 ， 使 用 浓 度 为0.1%0.02% （ 活 性 成 分 约 为1.5% ） 。 其 作 用 机 理 为2 种 活 性 成 分 在 与 细 胞 膜 接 触 几 分 钟 后 ， 可 立 即 渗 透 到 膜 内 并 抑 制 细 胞 内 酶 的 活 性 ， 从 而 抑 制 细 胞 生 长 代 谢 、 大 分 子 合 成 ， 引 起 细 胞 内 能 量 水 平 迅 速 下 降 ； 由 于 能 量 体 系 的 崩 溃 ， 细 胞 不 能 合 成 日 常 代 谢 所 需 要 的 化 合 物 ， 从 而 导 致 菌 体 死 亡
21、7 。 这 类 防 腐 剂 能 与 氯 及 大 多 数 阴 、 阳 离 子 及 非 离 子 表 面 活 性 剂 混 溶 ， 且 在 较 高 的 使 用 浓 度 下 不 会 影 响 酶 活 性 。pH 适 用 范 围 广 （pH28.5 ） ， 化 学 稳 定 性 好 。 经 实 验 室 检 测 ， 在25 下 保 存2 年 ， 该 防 腐 剂 的 活 性 组 分 仅 损 失3% ， 与 水 可 以 任 意 比 混 合 。 Proclin 系 列 防 腐 剂 具 有 多 标 靶 作 用 位 点 ， 因 此 大 大 降 低 了 因 变 异 产 生 的 微 生 物 的 耐 药 性 ， 是 一 种 理
22、 想 的 可 替 代 硫 柳 汞 、 叠 氮 化 钠 和 庆 大 霉 素 的 生 物 防 腐 剂 。 但 遇 铵 、 亚 硫 酸 盐 、 强 还 原 剂 和 强 碱 性 会 降 低 其 活 性 ， 在 过 量 使 用 下 有 一 定 的 刺 激 性 和 致 敏 性 。 3 结 语 在ELISA 等 体 外 诊 断 试 剂 研 发 过 程 中 ， 试 剂 的 稳 定 性 是 制 约 产 品 市 场 化 的 关 键 。 国 外 已 有 多 项 有 关 体 外 诊 断 试 剂 防 腐 剂 的 专 利 ， 而 国 内 仍 在 探 索 阶 段 。 随 着 体 外 诊 断 试 剂 的 不 断 发 展 ，
23、对 防 腐 剂 的 要 求 也 会 越 来 越 高 ， 对 人 体 及 环 境 毒 害 大 的 防 腐 剂 ， 如 硫 柳 汞 、 叠 氮 钠 等 将 会 逐 渐 被 取 代 8 。 今 后 防 腐 剂 将 会 朝 着 广 谱 、 高 效 、 低 毒 、 环 保 的 方 向 发 展 。 表1 诊 断 试 剂 常 用 防 腐 剂 比 较 防 腐 剂 叠 氮 钠 硫 柳 汞 庆 大 霉 素 异 噻 唑 啉 酮 类 作 用 原 理 抑 制 酶 活 性 抑 制 酶 活 性 与 核 糖 体 结 合 抑 制 酶 活 性 优 点 效 果 显 著 广 谱 ， 抑 菌 力 强 抗 菌 谱 较 广 高 效 ， 性
24、 质 稳 定 缺 点 剧 毒 ， 抑 制 多 种 酶 有 潜 在 危 害 易 产 生 耐 药 性 有 一 定 刺 激 性 和 致 敏 性 黄 倩 云 等 ： 体 外 诊 断 试 剂 防 腐 剂 的 选 择 策 略 593生 物 技 术 通 讯 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.24No.4 Jul.,2013 参 考 文 献 1 郭 凡 礼. 2009-2012 年 中 国 诊 断 试 剂 行 业 投 资 分 析 及 前 景 预 测 报R. 中 投 顾 问 产 业 研 究 中 心, 2010:21. 2 薛 虹 宇, 印 桂 琪. 防 腐 剂 的 作 用 及 有 效 性 评
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