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农杆菌转化法原理.doc

1、农杆菌转化法原理:农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有 Ti 质粒和 Ri 质粒,其上有一段 T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将 T-DNA 插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的 T-DNA 区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。

2、农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应,主要包括:受伤的植物细胞为修复创伤部位,释放一些糖类、酚类等信号分子。在信号分子的诱导下,农杆菌向受伤组织集中,并吸附在细胞表面。转移 DNA 上的毒粒基因被激活并表达,同时形成转移 DNA 的中间体。转移 DNA 进入植物细胞,并整合到植物细胞基因组中。方法:(根据不同受体环境基因要求而不同)1 农杆菌准备2 外植体的准备(愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片);3 用 MS-AS 液体培养基稀释原菌液 15 倍(1.5ml / 20ml)或离心后稀释 3 倍;4 外植体与菌液共培养 20 分钟;5 放置在带滤纸的培养皿上(注意充分吸干多余的菌液);6 将外植体接种到 MS-AS 固体诱导培养基,培养 23 天 ;7 移至含卡那霉素(Kan )300mg/L 和羧苄青霉素( Cb 300mg/L)的固体筛选培养基上进行 Kan 抗性愈伤组织的筛选;8 隔 20 天,进行第二次筛选;9 抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗;10 在生根培养基上生根,获得完整的再分化植株。

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