1、 荧光原位杂交技术（ FISH）常见问答 对于 FISH 操作来说，那些因素比较重要？ 在 FISH 中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的 PH 值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA 的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂 pH 是否符合要求直接关系到 FISH 的稳定性。 在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？ 发生上述现象最大的可能是 FISH 操作的环境温度发生了变化导致的。在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使 FISH 得不到良好的杂交效率。此外，探针的 保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。因此保证 FISH 操作中的温度非常
2、重要。 该如何保证 FISH 操作中的温度？ 最佳的措施是使用一些 FISH 的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先要对 FISH 操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在 1 度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在 20 度以上，对于在冬季进行的 FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检 测的样本最好不能超过 4 块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的
3、量本就不多（ 10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标 DNA 的杂交效率。因此对上述小部件的预热也能有效地提高 FISH 的杂交效果。 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。但随后信号急剧衰减。几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？ 在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光 信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。也可以在封片观察
4、时加入一定的 antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。 如何配制各种试剂呢？ 强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用 pH 计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。每次 FISH 使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？ 所谓的直标型探针是指 DNA 探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指 DNA 探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针半抗原荧光素基团，类似 “三明治 ”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、
5、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在 FISH 检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。 我能对同一样本进行多次的 FISH 操作吗？ 在多数情况下，如果 FISH 操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。 外周血样本的处理： 1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片 2、将样本片浸泡于 70、 85和 100的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建
6、议将变性的时间缩短一半，但不得少于 3 分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间 就无需减少了。 对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。曾有报道在同一样本片上进行了多达 8 次的FISH 操作。 也可对已经进行 G 带显色的样本片进行 FISH 操作： 将样本片浸泡于 70、 85和 100的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于 3 分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。 H21)易位发生在至少 25%的儿童 B 系急淋患者中，但是由于相互易位染色体的带型与大小很接近，常规
7、细胞遗传学方法的检出率还不到 0.05 18 。那么还有多少未知的染色体畸变不能用常规方 法检出，因而也不能用 FISH 定位。在这方面，用 24 色 FISH 将能大大提高检出率。同样，至今我们仍不知道有多少白血病患者有正常的染色体核型 (多数实验室报道约15% 20%)， mFISH 的应用可能为回答这一问题提供有力的手段。 许多肿瘤有着十分复杂的染色体重排，这些重排染色体被称为标记染色体(marker chromosome)。 mFISH 在确定标记染色体的来源方面有着突出的优点，根据标记染色体上不同的颜色能很快确定其来源。 Speicher 等 8 用 mFISH 分析了鳞状细胞肉瘤细
8、胞系 HTB43，很快地确定了 其标记染色体的结构重排和各自来源。可以预见， mFISH 与常规核型分析联合应用将会使恶性肿瘤染色体异常的诊断达到前所未有的准确。 2.3 生物学研究 mFISH 可用于种间进化研究，通过比较细胞遗传学来检查种系发生，分析染色体结构域及它们的相互关系 12 ，特别可以用于检查不同物种染色体序列的同源性程度，在植物、生物进化、农业研究中起到重要的作用 5， 8，12 。 mFISH 还能用于间期细胞遗传学研究，检测基因的扩增，分析核内组织，定义染色体结构域或多基因家族，确定细胞周期及疾病阶段，为染色体结构和功能研究 提供新的信息 5， 8 。 总之， mFISH
9、能应用于临床研究、肿瘤诊断和科研等各方面，有其独特的适用范围及优点。它将是传统细胞遗传学最好的补充。 FISH 的出现，使细胞遗传学进入了一个彩色的时代，而 mFISH 将是这个时代中又一重要的标志。可以预见的是更多的色彩将同时出现在一张标本上，为我们提供更多的细胞遗传学信息。 (本文编辑 刘萍 ) 作者单位：徐岚（ 200025 上海第二医科大学附属瑞金医院血液学研究所细胞遗传学实验室） 陈赛娟（ 200025 上海第二医科大学附属瑞金医院血液学研究所细胞遗传学实验室） 参 考文献 1， Gray JW,Kallioniemi A,Kallioniemi O,et al.Molecular
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