1、微生物学实验,基础医学院 显微形态实验室微生物学实验室,医学微生物学,实 验 一 细菌形态学,显微形态实验室 基本要求,1.显微镜为精密仪器，应严格按照操作规范使用。按照老师要求认真观看摆好的示教镜。 2.组织切片为易碎材料，应放置于指定位置，规范使用。 3.显微镜观察室严禁喧哗，有问题需举手示意，然后提问。 4.实验作业（绘图）写在实验报告册上，当堂交给带课老师,实 验 室 规 则,1.实验前要做好实验预习，进实验室只带必要的文具、讲义，并穿工作服。2. 实验室内应保持清洁、安静，实验时要认真严肃，禁止抽烟、饮食和开玩笑。 3.爱护实验器材，注意节约实验材料，实验室内任何物品不得带出室外。4
2、.注意安全，若带菌材料污染桌面、地板、书籍和衣物或误吸入口，应立即报告教师进行处理。,5.实验中待培养的材料应放在培养区，实验用过的带菌材料如吸管、玻片等应放在消毒缸、消毒箱等消毒区，不得放在桌上或冲洗于水槽内。6.实验完毕，值日同学负责整理清洁桌面打扫实验室，并关好水、电、门窗，洗手后方可离室。,一、实验内容,1、显微镜油镜的使用 2、革兰氏染色法 3、细菌的基本形态和特殊结构的观察,二、实验目的,1.掌握油镜的原理和使用方法。 2.了解革兰氏染色的原理及意义；掌握细菌涂片制作及革兰氏染色的基本操作方法。 3.能运用革兰氏染色对细菌进行分类。,一、油镜的使用 油镜头的识别镜头上标有放大倍数1
3、00镜头下缘常有一圈黑色线透镜孔径最小，而且有英文标示。（显微镜的物镜有低倍镜头，高倍镜头和油镜头，其中油镜的放大倍数最大）,油镜的原理,滴香柏油后可以增加油镜视野的亮度。,镜检把载玻片固定于载物台上，使油镜头对准镜筒。于载玻片上滴一小滴香柏油，眼睛从镜筒侧面看，旋转粗调节器，使镜筒下降浸入镜油并贴近标本，但勿触及玻片。然后从目镜中观察，并反向调节粗螺旋使标本缓慢离开油镜头，至看见有模糊影象时，用细螺旋调节至影象清晰。,观察完毕，取下标本片，立即以擦镜纸拭去镜头上的油后，再用擦镜纸沾二甲苯少许擦拭干净。显微镜使用完毕，下降载物台旋转物镜转换器，低倍镜对准通光孔，灯泡调节旋纽调至最小，关闭电源。
4、,油镜的保护,二、革兰染色,1.细菌涂片的制作 2.染色 单染色法复染色法 革兰氏染色法抗酸染色法,1.细菌涂片的制作1）涂片取清洁载玻片一张，用特种铅笔画两个直径约1cm大小圆圈，将接种环于酒精灯外焰灼烧灭菌，取一环生理盐水放置于玻片上，将接种环灭菌待冷后取大肠杆菌或白色葡萄球菌少许和生理盐水混合,均匀涂抹在玻片上。,2）干燥涂片置室温自然干燥，必要时可将标本面朝上，放在离火焰较高处微微烘干，但切勿在火焰上直烤。,3）固定标本面朝上，用钟摆样速度来回通过火焰三次。,2.革兰染色法 1) 初染: 结晶紫染色液, 1分钟 ) 媒染: 革兰氏碘液, 1分钟 ) 脱色: 95%酒精, 30秒 ) 复
5、染: 番红染色液, 30秒,革兰染色,革兰染色结果,油镜下模式图 1000,原理（1）等电点： G等电点低，带负电荷多，与带正电荷的结晶紫结合牢固（2）细胞壁结构：成分、肽聚糖层数等,Gram Stain,革兰阳性菌细胞壁结构,革兰阴性菌细胞壁结构,G+菌与G-菌细胞壁的区别,细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌 强 度 较坚韧 较疏松 厚 度 2180nm 1015nm肽聚糖层 可达50 层 12层肽聚糖量 50%80% 5 %80%糖类量 约45% 15%20%脂类量 1%4% 1122%磷壁酸 外 膜 ,的意义,Gram Stain,1.将细菌区分为2大类 2.指导临床合理选择抗菌药物 3.用
6、于细菌致病性等方面的研究,细菌的基本形态可分为球菌、杆菌、螺形菌（包括弧菌）三类。,三、细菌的基本形态和特殊结构的观察,1球菌如葡萄球菌经革兰氏染色后为球状，常堆集成葡萄串状，呈紫色。,葡萄球菌,肺炎球菌,链 球 菌,2杆菌如大肠杆菌经革兰染色后呈淡红色杆状，两端钝圆，散在排列。,大肠杆菌,大肠埃希菌 鞭毛和菌毛 （透射电镜 42500）,3螺形菌如霍乱弧菌经革兰染色后呈红色弧形，菌体微弯，如逗点状，或呈眉毛状，散在排列。幽门螺杆菌呈螺旋状、U状、S状及海鸥展翅状。,幽门螺杆菌,4. 细菌的特殊结构,荚膜、芽胞、鞭毛、菌毛1)荚膜(capsule)： 定义：某些细菌胞壁外围绕一层较厚的粘液性物
7、 质，称为荚膜。 形成条件：动物体内、营养丰富的培养基内 化学成分：多糖 分类：荚膜、微荚膜、粘液层-糖被 功能：鉴别细菌、分型依据（因有抗原性）致病性有关（抵抗吞噬、消化等）,荚膜（革兰染色）荚膜为菌体周围的一层透明圈,2) 鞭毛（flagellum）定义：为附着在某些菌体上的细长而 呈波状弯曲的丝状物种类：单毛菌：如霍乱弧菌 双毛菌：如空肠弯曲菌丛毛菌：如铜绿假单胞菌周毛菌：如伤寒沙门菌化学成分：蛋白质性质：是运动器官,电镜下：基础小体钩状体丝状体鞭毛的功能：鉴别细菌：鞭毛（动力）的有 无、数目、位置、排列、抗原性与致病性有关：粘附性,变形杆菌（鞭毛）,鞭毛 （鞭毛染色）,3)菌毛(fim
8、bria or pili)定义：某些细菌表面遍布着比鞭毛 纤细、短而直的丝状物。只有在电镜下才能观察。 化学成分：主要是蛋白质 菌毛的种类与作用： 普通菌毛：数量多，粘附于受体上-致病性 性菌毛：少，雄性菌（F+)，雌性菌（F-)-接合；噬菌体吸附受体,4)芽胞(endospore or spore) 定义:细菌在一定环境条件下，胞浆脱水浓缩，在菌体内形成的多层膜状结构的圆形或卵圆形小体。 形成条件：缺乏营养物质，有害代谢产物堆积 性质：是休眠状态，不是繁殖方式 种类： 功能: 鉴别细菌：大小、形状、菌体内的位置 对细菌起保护作用：多层膜包绕，通透性降低 作为灭菌是否彻底的指标：抵抗力强,细菌芽胞形状、大小和位置,破伤风杆菌的芽孢,牙垢涂片革兰染色：镜下可见革兰染色阳性与阴性、排列不规则的球菌和杆菌，有时可见到螺旋体，注意将细菌与食物残渣、脱落细胞相区别。,【实验报告】,绘图：1. 示教镜镜下图2.自己制作的标本片镜下图,医学实验基本技能 第四章：显微形态实验基本操作技能,链球菌,革兰染色 1000,1000,
