1、口服四联活菌肠溶胶囊临床研究 SOP 第 1 页 共 3 页粪便涂片法检查菌群失调标准操作规程一、革兰染色液的配制（科氏改良法）共 5 种液体，分为结晶紫 A 液，结晶紫 B 液，革兰碘液，脱色液，复染液。染液名称 配制方法1 结晶紫 A 液 结晶紫 0.25g（研磨后） ，加乙醇（2ml，95%） ，再蒸馏水 98ml2 结晶紫 B 液 Na2CO3 1.25g，加蒸馏水 100ml3 革兰碘液 NaOH 0.1g 溶于 2.0ml 蒸馏水中，加 I2 2.0g ， KI 4.0g，再加蒸馏水至100ml4 脱色液 丙酮 30ml+乙醇 70ml（95%）5 复染液 沙黄 2.5g3.0g
2、加入乙醇（95%）10ml，溶解后加入蒸馏水 100ml（或用 10%石炭酸复红液 10 稀释即可）二、涂片制作1、取样：粪便标本送检时，观察标本性状，并“多位点”挑取或沾取粪便标本；2、推片与固定：以 3040 度角推片，面积 11.52cm，自然干燥后，酒精灯上火焰上能过 3 次固定（制作涂片 2 张，其中作为一张备用） ；3、染色：第一步，先加 A 液淹没标本，再加 “等量”B 液混合，染色 1 分钟；水轻柔冲洗掉；第二步，加革兰碘液，12 分钟；水轻柔冲洗掉；第三步，加脱色液 20 秒到 30 秒，根据情况而定，如涂片稍薄时就适当减少染色时间；水轻柔冲洗掉；第四步，最后复染 30 秒，
3、冲洗后晾干或吸干。4、涂片制作注意要点：1、涂片不可太厚，亦不可太薄，太厚则细菌总数增加，且影响观察，太薄则涂片所见细菌总数减少，厚薄如血膜为宜。2、注意把握染色时间，好的染色是能够清晰准确观察的必要条件。口服四联活菌肠溶胶囊临床研究 SOP 第 2 页 共 3 页三、镜下观察1、确定涂片和染色情况：涂片要均匀，菌体不变形，革兰阳性和革兰阴性反差要好。2、总览细菌总数：观察总数的多少，以及有无优势菌或真菌等。其评定标准见肠道粪便检查图谱 。3、观察 G+杆菌、G +球菌、G -杆菌、G -球菌比例：选定有代表性的视野，计数并判定其大概比例（有经验者可根据经验判定） 。计数方法可选用纸片打孔缩小
4、视野计数法来计数；亦可选定有代表性视野，数一定数量的细菌，再计数各种比例。四、结果判定:请按照下表进行参照填写每个患者的菌群失调化验单（四联活菌肠溶胶囊临床试验专业）评 定 参 考 标 准正 常 参 考 值I 度失调 度失调 度失调分 析结 果（检验师填写）大便性状正常成形或成型软便 正常成形或不成形软便、稀便多数为程度不等的稀便，也可为粘液便、水样便、脓血便或柏油样便多数为程度不等的稀便，也可为粘液便，常呈黄绿色或黑色涂片所见细菌总数 5005000/油镜视野（计数 5 个油镜视野细菌数的均值） 细菌总数在正常范围（5015000/HP） 、正常低值或略有减少（101500/HP）细菌总数明
5、显减少（11100/HP）或无明显改变细菌总数呈显著减少（10HP ）革兰阳性杆菌50.2%-74% 正常范围低值明显减少革兰阴性杆菌35.29%-44% 多数会稍有增加革兰阳性球菌2%-10% 正常范围高值或增多革兰阴性球菌0.5-5%革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=50-74：35-44：2-10：0.5-5革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=50：45-50：13-30：5-10革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=35-40：50：30：10杆菌：球菌 3:1 1:1 2:1 可能会出现比细菌总数呈显著减少，粪便中原来的菌群大部分成员被抑制而消失口
6、服四联活菌肠溶胶囊临床研究 SOP 第 3 页 共 3 页（杆菌革兰阳性杆菌革兰阴性杆菌）（球菌革兰阳性球菌革兰阴性球菌）例倒置镜下印象：1. 肠道菌群未见明显异常 2. I度菌群失调改变 3. II度菌群失调改变 4. 度菌群失调改变五、其它说明：1、尽量用新鲜粪便进行检测，时间半小时之内，如果耽搁时间较长，可以取稍微量多的粪便样本，取样时挑取中心位置的粪便。2、遇粘液便，胨样便或水样便亦可采用牙签进涂片。3、镜检时，应将涂片视野全面观览，不可只看几个视野就计数或报告，以防误差。六、参考文献：张秀荣. 肠道菌群粪便涂片检查图谱M.北京：人民军医出版社，2000.1-25.制作：杭州龙达新科生物制药有限公司研发部日期：2008 年 4 月
