1、 发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）1发酵法生产维生素C的综述摘要：维生素 C（英语：Vitamin C，又称 L-抗坏血酸）是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。抗坏血酸在大多的生物体可借由新陈代谢制造出来，但是人类是最显著的例外。最广为人知的是缺乏维生素 C 会造成坏血病。在生物体内，维生素 C 是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的威胁，维生素 C 同时也是一种辅酶。其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。维生素 C（英语：Vitamin C，又称 L-抗坏血酸）为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯，Vc 主要来源新鲜水果和蔬菜，是高等灵长类动物与其
2、他少数生物的必需营养素。Vc 有 L-型和 D-型两种异构体，只有 L-型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。其结构是一种含有 6 个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为 C6H8O6，分子量为176.1。天然存在的抗坏血酸有 L 型和 D 型 2 种，后者无生物活性。维生素 C 是呈无色无臭的片状晶体，易溶于水，不溶于有机溶剂。在酸性环境中稳定，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是由氧化酶及痕量铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破坏。氧化酶一般在蔬菜中含量较多，故蔬菜储存过程中都有不同程度流失。但在某些果实中含有的生物类黄酮，能保护其稳定性。0 前言维生素 C 的发酵是指通过发酵作
3、用将原料转化为维生素 C，再通过生物分离技术将其从发酵液中分离提纯，获取满足要求的维生素 C 产品。维生素 C 的发酵过程中包含菌种的培育、菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治六个方面。概括地说，在发酵的整个过程中要选育出优秀的发酵菌种并采取合理有效的方法予以保藏，保持其优良性状；在实际生产时要对菌种进行扩大培养，满足生产上对发酵菌的数量要求；对于发酵还应全面的考虑发酵的消耗、产率问题，并通过适当的控制方法提高效率；染菌和污染是发酵过程中的一个非常严重的问题，需要严格控制，频繁检测确保发酵罐安全，避免或较小损失。1 发酵机制目前，维生素 C 发酵主要有葡萄糖发酵和山梨
4、醇发酵，工业中使用的发酵方法分别为莱氏法和二步发酵法。1.1 葡萄糖发酵葡萄糖发酵是以葡萄糖为原料生产维生素 C 的发酵方法。该方法包括莱氏法、新二步发酵法和一步发酵法，但后两种由于技术等原因尚未应用到生产中，这里将简要介绍介绍一下。发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）2氏法是一种化学合成与一步发酵相结合的生产方法，生产工艺路线成熟，生产原料便宜易得，产品质量好，收率高。因此至今瑞士的 Roche、日本的 Takeda、德国的 E.Merk 和 BASF 等国外生产维生素的主要公司均采用该方法。该方法生产工序多、过程长，难以连续化操作；使用大量有毒、易燃
5、化学药品，造成环境污染等。为此，自上世纪 60 年代开始，世界各地的科学家都致力于简化该生产路线的研究。 1,20,21其合成路线如图 1。图 1. 莱氏合成路线新二步发酵法（相对于二步发酵法而言，将在后面对二步发酵法进行介绍）也称葡萄糖串联发酵法，是由 D-葡萄糖依次经欧文氏菌、棒杆菌发酵生成维生素 C。该法工序简单，但在原料和菌体处理等方面均有待改进提高，尚未能应用到工业生产中去。一步发酵法是在新二步发酵法的基础上，利用生物技术，采用重组 DNA 技术，构成工程菌，实现从 D-葡萄糖到 2-KGL 的一步发酵。 1目前，该方法尚处于研究之中。1.2 山梨醇发酵山梨醇发酵上世纪 70 年代初
6、，我国的尹光琳等发明了二步发酵法的新工艺，它是目前唯一成功应用于 VC 工业生产的微生物转化法 1，是通过生物发酵得到 2-酮-L-古洛糖酸，这有别于莱氏合成法中的化学合成，其发酵成分较莱氏合成法更多。 20-22其发酵路线如图 2（仅为发酵过程的一部分，其余过程与莱氏法相同） 。图 2. 二步发酵法发酵路线本文将以 D-葡萄糖为开端，重点介绍二步发酵生产维生素 C 的过程，其中包括菌种的培育、菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治等方面的内容。2 菌种的培育二步发酵生产维生素 C 过程中用到的菌系为混合菌系 23，包含的发酵菌种类很多，这里将主要介绍巨大芽孢杆菌菌种的
7、培育。 （由于生黑醋杆菌的相关资料查不到，这里就不进行论述了，可以考虑从相关机构或科研院所直接获取现成的生黑醋酸杆菌，这也是获取菌种的一种方法） 。2.1 菌种特性巨大芽孢杆菌：杆状，末端圆；单个或呈短链排列，1.21.52.04.0 微米；能运动；芽孢1.01.21.52.0 微米，椭圆形，中生或次端生；能够液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原说明：目前生产中假单孢杆菌已被巨大芽孢杆菌取代发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）3硝酸；巨大芽孢杆菌为产孢杆菌，且为革兰氏阳性菌及好氧菌，也为常见的油中腐生菌。2.2 菌种的分离从巨大芽孢杆菌的特性分析，可以
8、从腐败的食用油中分离巨大芽孢杆菌。具体方法是取适量腐败食用油，将其放入适合巨大芽孢杆菌生长的培养液中剧烈震荡，使其中的细菌大量进入到培养液中稀释溶液到适当的倍数，在合适的培养基上涂布、培养，长出纯的的单菌落，对单菌落中细菌进行分析，确定巨大芽孢杆菌。分离培养基成分（%）：酵母膏 0.3、牛肉膏 0.3、玉米浆 0.3、蛋白胨 1.0、KH2PO4 0.1、MgSO4 0.04、尿素 0.1、CaCO3 0.1、山梨糖 2.0、琼脂 2.3、10ppm FeSO4 0.1mL/L、pH=6077.0 2。2.3 菌种的检验接下来进行的步骤就是对纯菌落中的细菌进行检验，确定巨大芽孢杆菌。进行该步骤
9、在目前比较先进的方法是多重 PCR 技术检测。其基本方法是挑取培养基上单个菌落, 接种于营养肉汤液体，30快速振摇培养 16h，, 离心取沉淀, 采用硅藻土吸附法快速提取各菌株的基因组 DNA, 作为 PCR 的模板 3。然后对所获取的 DNA 利用 PCR（聚合酶链式反应）进行扩增，获取足够量的 DNA，以便进行测序。测序工作可送到专门服务公司进行，如海生工生物工程技术服务有限公司。若要对菌种的形状加以改良，提高效率或增强环境适应能力等，可通过诱变育种、杂交育种、基因工程育种或人工选择等方法进行，如通过基因工程育种获得了能够生产胰岛素的菌种，利用射线照射、太空失重育种等。由于本文未涉及菌种改
10、良就不详细叙述菌种改良这一方面的内容。3 发酵环节的控制发酵控制贯穿了整个发酵过程，由于发酵过程受到诸多因素（如:发酵菌体本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等）交叉影响，发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。要想很好的对其进行控制以达到充分发挥菌种生产潜力的目的，就需要全面了解菌种本身的代谢特点（如生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统） 、代谢速率)菌代谢与环境的相关性（如温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等） ，对各参数进行调节。 24发酵控制的参数分为物理参数、化学参数和生物参数三种。其中物理参数包括温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧
11、（二氧化碳）浓度等；化学参数包括基质浓度（包括糖、氮、磷） 、pH、产物浓度、核酸量等；生物参数包括菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、基质消耗速率、关键酶活力等。在二步发酵法生产维生素 C 过程中需要控制的参数有温度、溶解氧、菌浓度、发酵液浓度、产物浓度、pH、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。对这些参数进行控制的前提是测出这些量，针对其实际大小和理论大小的差异采取有效措施进行控制。针对工业中发酵生产维生素 C 主要是采用传感器实时测定并将信号传输到计算机中予以分析显示，制导控制。下面就详细叙述二步发酵法生产维生素 C 过程中的一些控制。3.1 伴生菌的控制研究发现蜡状芽孢杆菌等伴生菌对氧
12、化葡糖杆菌发酵将 2-酮-L-古洛糖酸转变成维生素 C 具有很好的促进作用（如在协助氧化葡糖杆菌克服酸性条件，提高氧化葡糖杆菌发酵能力等方面效果明显） ，故而在发酵过程中可采取添加优秀的伴生菌并创造是一起生长繁殖的条件可有效提高发酵效率。 7-发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）48，10,123.2 添加成分对发酵的影响在维生素 C 的发酵过程中的、添加成分分为两类，即用于发酵的原料成分和对发酵进行调节的非原料成分。前者主要是供发酵利用或供给发酵菌生长繁殖所利用，后者则主要是其调节作用，提高发酵效率。针对葡萄糖对二步法发酵生产维生素 C 的研究发现在发
13、酵 24 h 添加葡萄糖能有效地延迟大菌裂解,使大菌处于稳定期的时间延长,从而产生更多的促进小菌生长的营养物质,促进 2-KGA 积累。添加葡萄糖时间过早或过晚都可能会破坏混菌的发酵体系,使小菌生长速度不稳定,从而抑制了 2-KGA 量持续积累。研究还发现加糖量的不同也会影响古洛酸的产量，在工业生产中就必须对其加以控制，从而获得较高的产率。 9外加离子会通过对代谢的调整来影响发酵，通过对离子影响的研究,，合理添加离子可很好地控制代谢进行以达到预期目的。巨大芽孢杆菌主要通过其生长过程中的碱性分泌物和细胞外液中的活性蛋白对产酸菌起到伴生作用,前者促进产酸菌细胞增殖,后者激活并提高产酸菌关键代谢酶的
14、活力,从而最终提高混菌发酵体系的 2KGA 转化率。离子注入对巨大芽孢杆菌自身的生长及细胞繁殖并未产生显著影响。离子注入诱导巨大芽孢杆菌的碱性分泌物加速了产酸菌的细胞增殖,同时提供了更有利于产酸菌代谢的 pH 环境。巨大芽孢杆菌总胞外液提高了产酸菌的糖酸转化能力;从总胞外液中纯化出的山梨糖脱氢酶激活蛋白促进了产酸菌山梨糖脱氢酶的活力,而这种促进能力因离子注入的诱导而得到增强。吕树娟等13对 N+离子注入前后的巨大芽孢杆菌基因组 DNA 进行了 RAPD 分析,发现了出发菌和突变株基因水平上的变异。对于本研究而言,低能离子注入 BM80 后可能引起其 DNA 碱基的变异、插入、缺失等基因突变,发
15、生在碱性分泌物和胞外激活蛋白上的基因突变必然影响其生理生化水平上的表达,从而使其对产酸菌的伴生能力得到了提高。 113.3 酶的调控酶作为生化反应的重要参与者，对代谢的调控作用是无可替代的，掌握并将其应用在维生素 c 的发酵中可获得非常好的效果。如山梨糖脱氢酶通过增加该酶的量可加速反应，同时这也带来了温度调控、pH 调控及离子调控等方面的内容。 13-143.4 温度、pH 调控调节适宜的温度和 pH 是确保发酵生产的必要条件，这其中就需要了解发酵在不同情况下的问题和酸碱度需求情况，在发酵罐中安装相关的传感器，实时监测它们的变化并进行相关的调节。温度的调控主要是由于发酵过程中产热会导致温度过高
16、影响酶的活性，从而影响了发酵的正常进行，调控方法就是同冷却水冷却降温。pH 调控主要体现在发酵液的 C、N 比上，通过合体调发酵液，并实时添加相应成分可维持 pH 的相对稳定。由于一些例子会对酶的活性、发酵菌的活性造成影响，通过相应的离子来进行影响以达到相关的目的。3.5 发酵液的影响发酵过程中发酵液中的营养成分随时都在变化，各成分浓度的高低直接影响了发酵的进行速率，发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）5这就带来了恒化、恒浊两个概念。通常情况下有两种方式，一是发酵是通过补料在恒浊的条件下持续进行，同时连续不断的分理处发酵产品，避免反馈抑制作用；二是分批次
17、进行发酵，待一批原料发酵结束后进行分离提取维生素 C 后再进行下一批次的发酵工作。 16发酵的控制还有很多，而且不同的发酵其可控制因子也是有差异的，这里就不做过多的介绍。4 染菌与防治染菌是发酵工业中的一件反常让人头疼的事，非常小的疏忽就会在成巨大的损失，怎样预防、必究就想的格外重要。总的来说，染菌与防治是一个具体的发酵控制的一个方面。下面就具体介绍一下维生素 C 发酵过程中染菌的控制与防治。消除杂菌污染的关键是在发酵前进行彻底的杀菌，但其难度是非常大的，这就导致发酵过程中比较容易出现杂菌，若出现劣势种群或无害种群则不会造成太大的损失，一旦被有害种群或优势种群污染，损失往往是很大的，几十吨甚至
18、上百吨的发酵液就全部损失掉了。针对这种情况就需要随时的监控，当发酵罐中出现异常情况是立即进行相应的补救，如添加发酵菌，改变发酵观众的理化条件抑制杂菌的生长，提前放灌收获一些已经产生的维生素 C,将发酵液进行灭菌处理再从新接种发酵菌进行发酵或用这些发酵液来生产其他产品，这都可选用的减少损失的方法。另外，在二步法发酵生产维生素 C 工业中简便、快速、准确、灵敏检测维生素 C 含量，这在发酵的控制和补救中是必不可少的，高效液相色谱法和反高效液相色谱法就是两种比较好的检测方法。 17-195 总结二步发酵法生产维生素 C 过程较为简单，但发酵过程中细节问题较多，严格按照科学规律操作来选育菌种，保藏菌种
19、，制备发酵用种子，利用发酵动力学合理建立数学模型制导发酵控制，做好染菌与防治工作。在工业生产中还应注意根据实际情况灵活变动，提高理论的实用性，从而获得最大的效益。参考文献：1 田亚红，王丽丽，仪 宏. 维生素 C 发酵工艺研究进展J. 河北化工. 2005 年第 5 期 14-16.2 赵军. 维生素 C 二步发酵伴生菌的筛选及其条件优化D. 13-144 王静，冯文亮，王丽丽，,仪宏. 一株芽孢杆菌在维生素 C 二步发酵中对小菌的促进作用.生物加工过程J. 2009 年 1 月. 9(1) 24-28.5 魏东芝，袁渭康，尹光琳，袁中一，陈敏恒，维生素 C 二步发酵过程动力学模型的研究J.
20、生物工程学报. 1992 年. 8(3).6 焦迎晖, 张惟材, 谢莉, 袁红杰, 陈梦霞. 维生素 C 发酵中伴生菌对氧化葡糖杆菌的影响. 微生物学通报. 2002 年. 29(5) 35-38.7 张舟，冯树，江晶，王勇，张忠泽. VC 二步发酵伴生菌巨大芽抱杆菌的选育J. 微生物学杂志. 1999 年 6 月. 19(2) 8-10.发酵法生产维生素 C 的综述 环工 1302 刘定坤（2013011327）68. 张静. 基于生化策略和组学技术的维生素 C 生产菌株间生理冠希辨析D.说明：因其中一些文献有的是在写作之前总体阅读时使用的，有的是不同文献之间重合较大，而在本文中为给与明确标注。
