1、46紫 草 中 水 溶 性 成 分 提 取 、 纯 化 以 及 鉴 定陈 敏 黄 志 纾 *中 山 大 学 化 学 与 化 学 工 程 学 院 ， 有 机 化 学 研 究 所 ， 广 州 510275摘要 本文研究紫草中水溶性成分。通过改变水煮提取，索式提取和超声波提取这三种方法的反应时间，反应温度和反应时的水量比来确定水提取的最佳条件。再经过脱色，脱蛋白和衍生化处理后进行一系列定性鉴定，初步确定为结构较复杂的多糖。关 键 词 紫 草 水 溶 性 多 糖 衍 生 化 脱 蛋 白1 前 言紫 草 是 紫 草 科 植 物 的 干 燥 根 ， 性 寒 味 甘 ， 咸 ， 入 肝 ， 心 经 ， 有
2、清 热 凉 血 ， 解 毒 透 淤 等 功 效 ，用 于 血 热 毒 盛 ， 斑 疹 紫 黑 ， 麻 疹 不 透 ， 湿 疹 ， 水 火 烫 伤 等 。 经 过 前 人 的 研 究 表 明 ， 紫 草 含 有多 种 生 理 活 性 成 分 ， 这 些 成 分 具 有 抗 菌 ， 抗 炎 ， 抗 癌 ， 抗 生 育 ， 抗 甲 状 腺 ， 抗 免 疫 力 低 下 ，降 血 糖 ， 保 肝 护 肝 等 多 种 作 用 。 就 是 因 为 它 的 多 种 功 能 ， 所 以 紫 草 一 度 成 为 国 内 外 学 者 研 究的 热 点 。 先 前 的 学 者 大 多 研 究 的 是 紫 草 的 脂
3、溶 性 成 分 。 傅 善 林 等 从 新 疆 紫 草 及 其 根 的 石 油 醚提 取 物 中 分 离 出 萘 醌 色 素 类 化 合 物 。 例 如 ,-二 甲 基 丙 烯 酰 阿 卡 宁 （ ,-dimethylacrylalkannin） ， 乙 酰 紫 草 素 （ acetylshikonin） ,1-甲 氧 基 乙 酰 紫 草 素 （ 1-methoxyacetylshikonin） 等 等 。 这 些 成 分 已 经 得 到 深 入 研 究 ， 并 取 得 一 定 成 果 1。然而水溶性成分的研究却是前人未曾涉足的课题。而文献记载，古代人用紫草来医治梅毒，由于古代煎药都是用水，所
4、以可以大胆推测紫草的水溶性成分可能有医治梅毒的作用。因此，我们所做的工作就是提取紫草水溶性成分，并进行初步的分离和鉴定。由于植物的含水量对植物内部化合物结构性质有影响，所以作者首先测定了紫草的含水量，这样对水溶性成分的测定有鉴定参考作用。然后用最常用的三种提取方法，即水煮提取法，索式提取法和超声波提取法，分别改变它们的提取时间，提取温度以及提取时的水量通过比较产率来确定提取的最佳条件，再将产品进行一系列定性鉴定，初步确定其为结构复杂的多糖2 实 验 部 分2.1 试 剂 及 原 料紫 草 ： 广 东 省 医 药 公 司 （ 新 疆 产 ） ；药 品 ： 2， 4-二 硝 基 苯 阱 ， 香 草
5、 醛 ， 1-苯 基 -3-甲 基 -5-吡 啶 啉 酮 ， feiling 试 剂 等 ；*基金项目 中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02009）资助第一作者 陈敏（1980 年出生） ，女，中山大学化学与化工学院化学专业 99 级指导教师 黄志纾（导师） Email： 47试 剂 ： 正 丁 醇 ， 三 氯 甲 烷 ， 乙 醇 ， 乙 酸 异 戊 脂 等 均 为 分 析 纯 ， 广 州 化 学 试 剂 一 厂 ；2.2 实 验 仪 器旋 转 蒸 发 仪 ， ES52C, 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ； 岛 津 LC-6A 高 效 液 相 色 谱 仪 ； P
6、ERKIN-ELMER1700 红 外 光 谱 仪 ； UV-265 型 紫 外 -可 见 分 光 光 度 计 。2.3 实 验 方 法2.2.1 紫 草 含 水 量 测 定将粉碎了的紫草装于培养皿里置于烘箱，测定在 T=100，不同时间下烘前与烘后产品（连同培养皿）质量差，从而能较为准确地得出紫草的含水量。见表 1。2.2.2 不同提取方法我们采用水做溶剂来提取。为了得到最佳提取方法。我们选择索式提取，水煮回流提取及超声波提取三种方法通过改变条件进行提取。实 验 一 :固定水煮温度为 100 （索式提取与超声波提取不受温度影响）并固定各方法的水量比（1:100） ，其中水量比（w/w）=样品
7、量:水量。取 4g 粉碎了的紫草与 400ml 水置于 500ml 的圆底烧瓶。改变时间来提取。见表 2实 验 二 :水煮提取固定时间 t=10h，固定水量比（1:00） ，所用样品为 4g。改变温度来进行提取。见表 3实 验 三 :水煮和超声波两种方法在各自的最佳条件下改变水量比，所用产品均为 2g。见表 42.2.3 紫草提取的后处理及样品的脱蛋白先将溶液过滤除去紫草渣，然后加 5%的活性炭 2脱色，煮沸 3-5 分钟。再过滤，蒸馏至一定体积，剩下的溶液与乙醇用 1:5 的体积混合，冷冻静置过夜即可得絮状沉淀，然后再旋转离心，去掉上层清夜，固体放在红外灯烘干即可得产品。再进行称量比较产量。
8、取少量样品，用去离子水溶解。取粗产品溶液 4ml 与氯仿- 正丁醇（4:1）混合液 1ml，混合充分振摇 30min，离心1min，再将水相与氯仿相分开，此过程重复 4-5 次，再以离子水为空白溶液作紫外测定 3。 2.2.4 定性测定。见表 5共采用了成刹法，显色法，feiling 试剂法，红外测定 4以及样品衍生化后测 HPLC 等方法。衍生化步骤：将干燥过的大约 0.01g 的待测样品置于小试管里，依次加入 100ulPMP 溶液 1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮（0.5mol/l 甲醇溶液）和 100ulNaOH（0.3mol/l）,混匀后混于 70水浴中加热反应 30min,取出室温
9、放置 10min,再加入 125ul 盐酸溶液（0.3mol/l）, 中和，混匀后用2.5ml 乙酸异戊脂萃取，涡旋 3min，离心 15min，小心弃去有机层，再萃取一次得下层，加水750ml 混匀并离心 15min，用于 HPLC 分析。标准液为同样步骤衍生化后的葡萄糖，蔗糖，麦芽糖 5。3 结 果 和 讨 论3.1 含 水 量 测 定可得紫草含水量为 13.8%。48表 1：固定温度，改变时间测定含水量序号 时间（h） 温度（） 烘前质量（g） 烘后质量（g） 含水量（%）1 5 100 58.48 57.84 13.02 5 100 48.09 47.72 11.23 5 100 57
10、.69 57.06 13.34 10.7 100 54.41 53.88 13.55 10.7 100 46.79 46.34 14.06 10.7 100 48.12 47.5 15.27 22.9 100 99.58 58.95 15.48 22.9 100 46.86 45.30 15.39 22.9 100 56.75 56.34 13.53.2 各 提 取 方 法 不 同 条 件 下 的 产 率 比 较索式提取的基本原理是水蒸气遇冷凝结所落下的水珠（水珠的温度一般为 50-60）洗脱样品而得到产品，所以它不受提取温度和水量的影响。而超声波也不受温度影响。所以只有水煮需要进行温度测定。
11、而根据数据，产率随着水量比例的提高而增多，所以可得出结论，水溶剂增多有利于产率提高。其中产率=提取产品/原料。由于实验条件有限，故只做到 1:250 的比例。数据表明了在 T=100下于水量比例为 1:250 时的水煮提取为最佳实验条件。其原因估计为物质在水的溶解性受温度的影响较提取时间和水量比大，故温度为主要影响因素。表 2：改变时间，比较各方法提取的产率时间（h） 水煮提取产率（%） 索式提取产率（ %） 超声波提取产率（ %）2 1.364 1.246 2.92 1.27 0.997 2.75 1.82 8 2.52 3.94 1.059 2.62 2.22 10 3.74 1.83 1
12、1 2.18 12 2.65 2.82 49表 3：改变水煮的温度，比较产率温度（） 60 70 80 90 100水煮提取产率（）1.48 1.11 2.16 2.44 3.74表 4：改变水量比，比较各方法的产率水量比 1:100 1:150 1:200 1:250水煮产率（ %） 3.74 3.88 4.72 5.04超声波提取产率（ %）1.36 1.56 1.62 2.38*设定水煮 t=10h.T=100.超声波 t=2h3.3 脱蛋白处理后，从紫外图可看出，原本在波长为 300nm 左右的峰不见了，可见蛋白已除.。一般的蛋白波长都在 280nm，移至 300nm 的原因可能是测定
13、时的参比溶液的误差。应该用含有除了样品成分而具有其他成分的溶液做参比，而不应单纯用去离子水。3.4 定性鉴定表 5：定性鉴定的方法和现象方法 现象取一点 2，4-二硝基苯阱与样品水浴加热 有黄色沉淀20ml 乙醇+80ml 浓硫酸 +5g 香草醛+样品 有红点出现先用 6N 盐酸加热水解，再加入 feiling 试剂 有红色沉淀产生IR Vmax 3413(宽，强)， 1616，1147（宽，强） ，655，599（尖）水解衍生化后 HPLC 分析 显示有糖的存在4 总 结以上现象都证明了糖的存在，而从红外图更可看出，有多糖的羟基峰和特征峰。可判断为多糖。在实验过程中，第一次完全溶而析出的沉淀
14、再次溶出时并不完全，估计除了部分杂质外，还因里面的糖发生了角脂化。而由于活性炭的量，PH 值，脱色温度，脱色时间都会影响产率及物质结构，在分析其结构时要将这些因素考虑进去。本实验初步鉴定了紫草里的水溶性成分，确定其为结构非常复杂的多糖，具体结构还有待以后研究。致 谢 衷 心 感 谢 古 练 权 老 师 、 黄 志 纾 老 师 、 马 林 老 师 以 及 吴 海 强 师 兄 在 实 验 过 程 中 对 我 耐 心 的 教 导与 帮 助 ， 并 感 谢 创 新 基 金 对 本 实 验 提 供 的 资 助 。50参 考 文 献1 陈发奎.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民卫生出版社,1997：7
15、32-732严松柏,谈献和,胡玉涛.紫草的研究进展.时珍国医国药,2003.14(2)2 孙颉,何慧,谢笔钧.活性炭脱色对灵芝水提液活性成分的影响.化学工业与工程技术.2001.22(1)3 刘成梅,万茵,涂宗财等.百合多糖脱蛋白方法的研究.食品科学,2002,23(1):89徐建祥,宴志云,赵谋明等.食品与发酵工业,24(3)4.哈森其木格,贺锋嘎,周晓军.芥菜多糖的研究-水溶性芥菜多糖的提取纯化和部分理花性质的鉴定.内蒙古民族学院师院学报（自然科学报）,1994.9(2)高居易等.紫孢侧耳多糖的提取，纯化及性质的研究.福建师范大学学报（自然科学版）,1999.15（2）:83-875 马定
16、远,陈君,李萍等.柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成.分析化学研究简报,2002.30（6）:702-705 Studies on the Water-Soluble ChemicalConstituents from ChineseMedicine “zicao” Min Chen Zhi-shu Huang *(School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongshan University, Guangzhou 510275)Abstract In this paper, the chemical constituents s
17、olved in water of Chinese medicine “zicao” (the roots of Arnebia euchroma (Royle) Johnst.) were studied and qualitative analysized.The different extraction methods were used for finding out the optimism procedure.A series of analysis after decoloring, deproteining, and derivating showed preliminaryly this water soluble constituent as complex polysacckarideKeywords Zicao(roots of Arnebia euchroma (Royle) Johnst.),water-solubility, amylose，derivative，de-albumen
