1、一般实验室使用，仅用于 体外无内毒素质粒大量制备试剂盒 （离心柱型）用于大规模质粒制备（max preparations）目录号：DP2801 5次制备目录号：DP2802 10次制备使用手册2005年9月，第3 版深圳市中联生物科技开发有限公司ZL Biotech Corporation地 址：深圳市南山区桃源街道留仙大道1183号南山云谷创新产业园综合服务楼506-508 电话：0755-33372878传真：0755-8655 0193网 址：深圳市中联生物科技开发有限公司ZL Biotech Corporation一、试剂盒组成、储存、稳定性试剂盒组成 保存5 次（ DP2801） 1
2、0 次（ DP2802）RNase A 20 400l(10mg/ml) 750l(10mg/ml）溶液 P1 4 50 ml100 ml溶液 P2 室温 50 ml100 ml溶液 P3 室温 75 ml150 ml结 合液 PB 室温 80 ml160 ml去蛋白液 PE 室温 50 ml100 ml25 ml 50 ml漂洗液 WB 室温第一次使用前 请 加入指定量无水乙醇内毒素清除 剂 4 （一个月） 20 ml 40 ml 20 （ 长 期）洗脱 缓 冲液 EB 室温 15 ml 20 ml吸附柱 AC 室温 5 个 10 个收集管（ 50ml） 室温 5 个 10 个试剂盒在室温储
3、存18 个月不影响使用效果。注意事项1第一次使用时 ，将试剂盒所带全部的 RNase A 加入溶液 P1 后（终浓 度 100ug/ml）置于 4 保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可会有混杂 有微量RNA 残留， 这时可在溶液P1 中补加RNase A 即可。2第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!3环 境温度低 时 溶液 P2 中 SDS 可会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37水浴加热分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。4避免试剂长时间 露于空气中产生挥发、氧化、PH 值
4、变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。-1-六、疑难解答（Trouble shooting）出现的问题 可的原因 建议解决方法质粒DNA产量低培养基中忘加抗生素，非确保固体，液体培养基中都加质粒转化细胞过度生长 入了适当的抗生素。细菌培养时间太长，老化接种过夜培养板的新鲜单菌落细菌开始裂解于加了合适抗生素的培养基中培养12-16 个小时。使用了低拷贝数质粒建议使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。细菌培养时间过短，菌液 细 菌培 养 到 A600吸光 值为 2-4内细菌浓度过低 的时候收集菌体。细菌细胞裂解不完全使用建议的菌体处理量处理菌体，不要 过 量； 涡 旋或者吹打，确保菌体充
5、分重悬于溶液P1中，不应该见到未散开的细菌团块 ；加入裂解液 P2 裂解后，应该是粘稠和透明的。质粒DNA产量使用分光分光光度计定量常常偏高，使光度计定量不准确用琼脂糖电泳/EB 染色定量。洗脱效率不高 请阅读实验步骤15 和注意事项6未提取到质粒DNA漂洗液 WB 中忘 记 加无水第一次实验时，在漂洗液WB乙醇 中加入指定量无水乙醇。质粒洗脱液含有较多乙确保已经做了步骤14，将离心醇，琼脂糖电泳/EB 染色吸附柱的乙醇残留去除；或者定量时质粒DNA 漂出上 适当提高上样缓冲液浓度。样孔-6-接前出现的问题 可的原因 建议解决方法质粒DNA下游酶切忘 记 做 步骤 14，乙醇 制做步骤14，然
6、后空气中晾分钟，不切开或者酶切 了酶切反应 让残留乙醇挥发。不完全 一些硅基质膜成分一起洗将洗脱的 质 粒 DNA 溶液 13， 000rpm脱下来，制了酶切反应再离心一分钟，小心取上清使用，质粒DNA降解，或者 核酸酶活性太高确保已经做了步骤11，使用去蛋白无质粒DNA 液 PE 去除了核酸酶。混杂有基因组DNA在裂解时基因组被剪切打 做步骤3时轻柔的通过颠倒混匀，污染 断了 不要涡旋或者剧烈震荡。质粒DNA上缺口或 裂解步骤3时间过长 裂解时间不要超过5 分钟。者电泳上超螺旋带前出现变性质粒带产物中含有RNA污第一次做实验时候，忘记 第一次实验前确保将RNase A 加染将 RNase A
7、 加入 P1 溶液，入了溶液 P1; P1 溶液超 过 3 个月的 ,RNase A 失活或者起始处可加入一些新 RNase A 在溶液 P1；理量过量处 理量不要 过 量；菌体重 悬 于 P1 溶液后可放置分钟让RNase A 充分起作用后再进行下一步。目录一、试剂盒组成、储存、稳定性1二、原理简介2三、试剂盒特点2四、注意事项2五、操作步骤4六、疑难解答6-7-质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2 、P3 的用量，洗脱缓冲液应在60-70预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。3得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶 电泳和紫外分光光
8、度计检测浓度与纯度。OD260值为1 相当于大约50g/ml DNA。电泳可为单一条带，也可为2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象 质粒泳动位置不一造成， 与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。公司产品正常操作情况下基超螺旋可以超过90%。4要知道质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量 Marker 才可以知道，处于环状或者超螺旋状态的的质粒泳动位置不确定， 是无法通过电泳知道确切大小的。5洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保PH 大于 7.5,PH过低影响洗脱效率。用 水洗脱质粒应该保存
9、在-20。质粒DNA 如果需要长期保存，可以用TE 缓冲液洗脱（ 10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，PH 8.0），但是 EDTA可影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。6无内毒素清除剂清除内毒素后质粒产量会有损失，根据不同的宿主菌株会损失10%-40%不等的质 粒产量。五、操作步骤* 第一次使用前请先在漂洗液WB 瓶中加入指定量无水乙醇!* 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于28保存。 1取 100-500 毫升过夜培养的菌液，16000xg，离心 3 分钟，弃上清，收集菌体，尽可的倒干上清。一般高拷贝质粒用100ml 菌液，低拷贝质粒用200-5
10、00ml 菌液。若使用大体积菌-3-液，请相应加大各溶液的体积。2用 9ml 溶液 P1 重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3加 9ml 的溶液 P2，温和地上下翻转 610 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA 剪切断裂！所用时不应 超过5 分钟！以免质粒受到破坏。 此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5 分钟。如果未变得清亮，可由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。4. 加 14.4ml 溶液 P3，立即温和地上下翻转6-10
11、次，充分混匀此 时会 出现白色絮状沉淀。室温放置5 分钟，室温16,000 g离心 15 分钟， 小心取上清，避免吸取到漂浮白色沉淀。 5. 将步骤4 所得上清液 转移到已放入预过滤柱中，每次转移10ml, 低速 离心 35 分钟，重复操作，直至所有上清全部过滤完毕，收集 滤液。此步骤为去除离心后残留杂质所用，每次上柱不要超过10ml，防止离心 时溢出。6. 柱预处理将试剂盒中的吸附柱按置于收集管上，加入10ml 溶液 P4，750010,000g 离心 3 分钟，弃去滤出液。此步处理会优化柱结合DNA 力。7. 柱结合将步骤5 的溶液转移至预处理过的吸附柱中，每次转移10ml ，750010
12、,000g 离心 3 分钟，弃滤液；重复操作直至所有溶液全部过滤完毕。8. 去蛋白 将 10ml 的去蛋白液 PE 加入吸附柱中，750010,000g 离心 3 分4钟，弃滤液9. 将 10ml 的漂洗液 WB 加入吸附柱中，750010,000g离心 3 分钟， 弃滤液。重复漂洗一次，750010,000g离心 3 分钟，弃滤液。空 柱 16,000g 再离心 5 分钟。室温放置3-5 分钟，除去残留乙醇。10将吸附柱按置于新的洁净收集管上，在吸附柱膜的中央 处加入2ml的水或洗脱缓冲液EB，室温静置 1 分钟，16,000g离心 3 分钟洗脱DNA。把水或洗脱液加热至60使用时有利于提高
13、洗脱液效率。11.将内毒素清除剂在冰上预 冷10分钟,将步骤10所得的含DNA的洗脱液，加入 1/10 体积内毒素清除剂, 混匀并于冰上放置 15 分钟，中间偶尔颠倒次，得到均一透明的溶液，再将此溶液放入37水浴15-20 分钟，溶液将变成云雾 状，室温 6000rpm 离心 5 分钟。在 1.5ml 离心管中操作更为方便，推荐使用。12. 沉淀&溶解 DNA将步骤11离心所得溶液上清转移到洁净的无内毒素的离心管中， 加入等体积的异丙醇，充分混匀，-20 放置 15 分钟，4 16,000g离心 30 分钟 ，弃去上清(注意：不要将 DNA沉淀倒出) ，用 70%乙醇 洗涤一遍， 4 16,0
14、00g离心 5 分钟，在超净台中弃去上清，干燥， 加入适量无内毒素的水溶解 DNA沉淀，所得即为无内毒素的高纯度质粒。第一步转移上清时，不要搅动下层的液层。-5-二、原理简介试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过独特的内毒素清 除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低PH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA 从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒特点1离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质
15、量 不稳定的弊端。2不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便，从 100-500 ml 大肠杆菌 LB(Luria-Bertani)培养液中，可快速 提取 0.5mg-1mg 纯净的高拷贝质 粒DNA ，提取率达80-90 %。3获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、 转染等各种分子生物学实验。四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！）1所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少16000xg，带50ml转头的台式离心机。2溶液P2 含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮 肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲 洗。3提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提-2-
