1、1课程论文论文题目：香樟茎石蜡切片的制作姓 名： 杨 飞 学号：0910070117系 部：生物工程系专 业： 生物教育 指导老师： 李 晓 宏 职称：副 教 授 中国咸宁二一一 年 五 月I目录摘要 I关键词 IAbstractIIKey words.II1.绪论 12.实验内容 12.1 材料：香樟茎尖 12.2 石蜡制片的操作程序 12.2.1 材料的采集、分割与麻醉 12.3 材料的固定与固定液的选择 22.3.1 固定的目的与性质 22.3.2 固定液的种类与性能 22.3.3 良好固定液具备的条件 52.4 材料的冲洗 52.5 材料的脱水 51.5.1 脱水的目的 51.5.2
2、脱水剂及其水法 52.6 材料的透明 62.7 渗蜡与包埋 62.7.1 渗蜡 62.7.2 包埋 72.8 切片 82.9 染色 92.10 封藏 102.10.1 封藏剂 102.10.2 封藏法 102.11 烘片 103. 讨论与探究 10参考文献 .12致谢 .13I摘要：运用传统石蜡切片和光学显微镜观察的方法， 对香樟的茎结构进行观察。通过实验我们了解到石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构。教 学 中 ，光 镜 下 观 察 切 片 标 本 多 数 是 石 蜡 切 片 法 制 备 的 。 活 的 细 胞 或 组 织 多 为 无 色 透明 ， 各 种 组 织 间 和 细 胞 内
3、各 种 结 构 之 间 均 缺 乏 反 差 ， 在 一 般 光 镜 下 不 易 清 楚区 别 出 ； 2组 织 离 开 机 体 后 很 快 就 会 死 亡 和 产 生 组 织 腐 败 ， 失 去 原 有 正 常 结构 ， 因 此 ， 组 织 要 经 固 定 、 石 蜡 包 埋 、 切 片 及 染 色 等 步 骤 以 免 细 胞 组 织 死 亡 ，而 能 清 晰 辨 认 其 形 态 结 构 。关键词：香樟茎；石蜡切片;染色IIAbstract:Paraffin sections using traditional methods and optical microscopy, the struc
4、ture of the camphor tree stems observed. We know by experiment, not only for observation of normal paraffin tissue morphology. Teaching, the light microscope most of paraffin section specimens prepared. Living cells or tissues are mostly colorless, transparent, and the cells of various organizations
5、 lack the contrast between various structures, in general, not easy to clearly differentiate the light microscope; tissue will die soon after leaving the body and produce tissue-corruption , lose their normal structure, therefore, the organization must be subject to a fixed, embedded in paraffin, sl
6、iced and stained tissue death and other steps to avoid, and its morphological structure can be clearly identifiedKey words: camphor stem; paraffin sections; staining11.绪论：人类很早就已利用自然界中生长的植物，并认识到根、茎、叶、花等方面的形态。但是对于植物的结构上的观察，一直到显微技术的发明以后才开始发展。起初用在显微镜下观察的方法是十分简陋的。到了十九世纪，物理学及化学随着工业革命有了重大发展以后，在观察生物的方法上，也起了
7、一个革命性的改变。目前一般应用的一些显微技术，可以说在上世纪末叶及本世纪初就已经奠定了基础。从显微水平、超微水平进入了大分子合和分子水平，都同显微技术的提高分不开。到目前为止，多年来已经创造的许多制片方法，可以使用于特定的材料和一定观察的目的，例如：单细胞的丝状的极薄的叶状体，以及幼小的胚胎等都可以在载玻片上压散或涂成一层，染色后制成压片或涂片。 【1】 复杂的及大块的组织通常可以徒手或滑行切片机切成薄片，不太坚硬的材料在切片前还可以埋藏在包埋物质（例如：石蜡、火棉胶或树脂中）然后切片。为了了解器官、组织与细胞中的物质含量和性质，以及确定这些物质的分布位置，都可以应用于各种显微化学试剂测试方法
8、。总之，制片的方法是繁多的，由于不断改善，不断创新，目前一般常用的方法已经达到几十种。制片的方法虽然很多，但是其共同特点和基本要求，不外乎要求尽量保持眼来结构的真像，切成适当的厚度，以及应用各种染色方法，使内部清晰易见，并且能使制片保持长久、不变形、不退色 1。2.实验内容21 材料：香樟茎尖2.2 石蜡制片的操作程序2.2.1 材料的采集、分割与麻醉2.2.1.1.材料的采集注意事项：1、须选择健全而有代表性的植物。2、在采集标本时尽可能的不要损坏植物体或所需要的部分。3、材料越小越好，但必须包含所需部位。4、要做好详细的记录：日期、时间、地点、天气、名称、采集人。在采集时应注意以下事项：
9、2茎：带有叶子的茎，采回来后可放在盛水的花瓶或其他容器内，养几天。如果在野外采集，易使不宜用上法保存时，可以将茎切成很长极端，用湿纸包起来，放在采集箱内带回实验室；但应注意不要折断和压碎。2.2.1.2 分割在讲一般方法时候，我们曾经提到杀生于固定要越快越好。务使各细胞立刻停止生命活动，而不是其原生质有崩溃现象发生。所以我们在固定材料的时候应该将所需要的部分分割成小块、段或片。以达到立刻杀生与固定的目的。一般分割叶片的时候，如果叶片狭窄不超过 5 毫米，则可以沿中横切，每片长约 3-5 毫米，如果叶片比较宽阔时，可以选择其中含有主脉，宽 3-5 毫米固定。草本植物的茎叶根分割时，常常切成圆盘状
10、，再分割成小块。再放在潮湿的纸上，等分割完毕之后，立刻放入固定液中。如茎的直径不超过 2 毫米，而其表面有高度角质化，则可以切成约 2MM 的小段，如果其表面非角质化，而且穿透容易，则可以切成 10MM 的小段。任何一种圆筒状器官，其直径为 5MM 长，其直径为 1CM 时，则可以将他的厚度切成 2-5MM。直径较大的茎可以切为 5MM厚，且可以分割一半或者四分之一。2. 3 材料的固定与固定液的选择 2.3.1 固定的目的与性质固定的目的在于保存组织内的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。2.3.2 固定液的种类与性能固定液的作用表现于对材料的改变，硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等
11、方面用刀片快速将材料切割好，立即投入盛有 FAA 固定液的标本瓶中，贴上标签，注明固定日期、固定液名称，固定 524 小时。固定剂的用量一般为材料的 2030 倍或稍多，同一标本管中的材料不宜太多，因组织在固定过程中，水分或其他溶解物渗出后会影响固定剂的浓度。固定过程中需不断震荡,能使组织块内水分充分脱出。同样一种固定液对某一种材料来说是良好的。但对另外一些组织就不是很实用了，所以在选择固定液时都应该利用。3固定液的名称性质概要 对穿透速度及小块组织所需的固定时间洗涤法组织收缩或膨胀硬化程度染色影响配方酒精 1、还原剂，不与氧化剂混合实用2、沉淀白朊与球朊3、沉淀核酸与肝糖，唯溶水。4、溶解类
12、脂物，能损坏线粒体及高尔基体1、快2、约1-3小时不需要冲洗，本身就是脱水剂收缩显著 显著 1 一般染色困难2 用苏木精、明矾、洋红染色良好3 对白朊及球朊染色较易70%-80%乙醇福尔马林1、还原剂2、不能使白朊及核蛋白了、凝固3、能保存内脂物，可以用线粒体和高尔基体固定1 中等2 约 2-4小时直接在 70%酒精中洗涤1 最初收缩很少2 经酒精脱水后及石蜡包埋后有强烈收缩高度为很好的硬化剂1 对苏木精染色良好2 染色质易染碱性3 细胞质找色困难10%福尔马林（3.7-4%甲醛）4醋酸 1、能凝固核内的核蛋白2、为染色质良好的固定剂3、不能固定内脂物4、不影响细胞质1 极快2、约 1小时直接
13、在50%70%酒精中组织膨胀 不硬化且防止酒精时硬化无影响 适当固定浓度0.3-5%常备溶液 10%苦味酸1、可以沉淀蛋白质2、2、对内脂物无作用3、不能固定碳谁化合物1 中等2 约 3-5小时直接投入70%酒精中收缩显著 硬化甚少易染色 苦味酸卡诺氏液1、纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质2、能溶解类脂物1、极快2、0.5-1 小时移入95%或纯酒精中换两次因为含有醋酸收缩减少无硬化无影响 1、纯酒精 3份冰醋酸1 份FAA 1 为固定剂2 固定一般植物时，不作细胞学的固定1 快2、约2-24 小时直接移入50%或70 酒精中醋酸的成分调节适当，收缩不显著硬化作用好无影响 1、%酒精 89毫
14、升2、冰醋酸 69毫升3、福尔马林 5毫升52.3.3 良好固定液具备的条件1、穿透组织速度快2、能将细胞中的内含物凝固成不溶解的物质3、不使组织膨胀或收缩，保持原形4、硬化组织的程度适中5、能增加细胞内含物的折光度，易鉴别6、能增加媒染作用及染色能力。7、具有保存剂的作用8、必须根据材料及制片的目的来决定选择2.4 材料的冲洗材料自固定液中取出来之后，须立即冲洗，使其中内含有的固定液全部出去，一直到洗干净为止。所用的冲洗液应该依固定液性质而定。1.4.1 酒精洗涤法：香樟自固定液中取出之后，直接投入装有适当酒精的小瓶中，材料与酒精的比例，应与 1:10 为准。洗涤次数与时间长短，依组织块得大
15、小和性质、固定液的种类和固定的时间等条件而定。组织较大而坚韧。固定时间较长，则洗涤时间也较长。香樟在开始换洗的一二次中，每次间隔的时间可以短些， 30 分钟，以后几次可以延长到 2 小时，最后在 70%酒精中过夜。2.5 材料的脱水1.5.1 脱水的目的脱水的目的在于使组织中的水分完全出去，并使组织变硬，若脱水不干净，就会影响结果，甚至完全失败。1.5.2 脱水剂及其水法最常用的脱水剂为乙醇，脱水从 90%（一分钟）的乙醇、100%（一分钟）乙醇、100%（一分钟）乙醇，再经过 2|3 的乙醇+1|3 二甲苯（一分钟） 、1|2 的乙醇+1|2 二甲苯（一分钟） 、1|3 的乙醇+2|3 的二
16、甲苯（一分钟）至纯二甲苯（5 分钟） 。材料大的，时间须延长， （如不能及时进行各级脱水或暂时不能埋蜡，材料可以放在 70酒精中保存。 ）在高度酒精中，不能过久。因酒精易使材料组织收缩硬化，过久则材料由硬而脆， ） 、切时易于粉碎。因而高浓度酒精，6不宜处理过久。在每级度中停留的时间，依照材料的大小、性质、以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。注意：1：在低浓度的酒精中，每级停留不易太长，否则易使香樟材料变软。助长材料的解体2：每及停留时间也不要太长，否则可使材料收缩变脆，影响切片3：脱水应该彻底干净，否则与二甲苯混合后，将呈乳白色浑浊，、虽可以倒回重脱，但是效果不好4：如果需要过夜
17、，应该停留在 70%酒精中2. 6 材料的透明组织块或切片在非石蜡的溶解剂中脱水后，一定要经过透明。透明可使组织中的酒精或丙酮被透明剂所替代；使石蜡能顺利的进入组织中，增强组织的折光系数，并能和封藏剂混合进行封藏。常用透明剂有二甲苯、氯仿等。二甲苯为最常用的透明剂，能溶解醇和醚，可为石蜡溶剂，他的透明力强，且不使染色切片退色，但是组织块在其中停留太久，容易收缩变脆变硬。为了避免组织收缩，在纯酒精脱水之后，并不直接移入二甲苯中，期间必须经过几个剂段，级别 1 2 3 4纯酒精 2|3 1|2 1|3 0二甲苯 1|3 1|2 2|3 1具体操作方法如下：纯酒精12344（分别一小时）二甲苯更常用
18、于切片封藏以前的透明，其优点是不易使染色褪色，切片在其中透明的时间，每级约 5-10 分钟。2. 7 渗蜡与包埋2.7.1 渗蜡在脱水和透明之后，下一步就是渗蜡。所谓渗蜡就是将包埋剂深入整个组织的过程，先将包埋剂，用具及渗入法分述如下：包埋剂：石蜡。石蜡为最常用的包埋剂，其熔点在 42-60 摄氏度之间，7包埋所用各种石蜡，其熔点在 50-60 摄氏度之间，依包埋的才来哦不同而来，软的用软石蜡，硬的用硬石蜡。性质好的石蜡，必须具备以下条件：1、熔点已知，2、结构细致，光滑而均匀， 3、无灰尘，水分及其挥发物质等。渗蜡的原理：石蜡通过溶于二甲苯渗入组织。渗蜡的方法：先用解剖刀吧石蜡切成小块，然后
19、再盛有材料及其透明的小酒杯内放一圆形有刺孔的纸片，把石蜡小块轻轻放入，其量约与透明剂相同，然后把小酒杯放入温箱即可，石蜡不能与材料的表面直接接触，用纸片隔开，烘箱的温度控制在 40 摄氏度，浸蜡时间稍长。在整个投入期间，一定要保持熔炉温度恒定，切忌忽高忽低，同时还须注意以下几点；1、尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度；2、力求在最短时间内完成石蜡透入的过程。温度过高或过低都会引起组织变硬、变脆、收缩等。2.7.2 包埋组织在被石蜡透入打到饱和的程度后，就需要进行包埋，所谓包埋就是在被石蜡所浸透的组织连同融化的石蜡，一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水之中，使他立刻凝固成蜡块的过程。 3
20、包埋用药品及有具：对组织块进行石蜡包埋与冷凝的容器称为包埋器。可用载玻片盒、盖玻片盒等，但经常使用的是用优质道林纸等光滑硬纸折叠而成的长方形纸盒。其大小视组织块的大小而定。折纸盒的方法如图 2所示2.7.2.1 蜡块的修整与固着：蜡块的修整 用单面刀片将石蜡块划分成小格，每小格中央有一组织块，8再深切割成一枚枚单个蜡块。准备一些长方形硬木块，大小约 222.5厘米左右。准备粘蜡块的一端要锯出一些横、纵沟槽，以增加蜡块与木块的接触面，使两者容易牢固地粘在一起。蜡块的固着与再修整。将上述木块有沟槽块的一端在溶化的石蜡中浸 2 小时，冷却后备用。将修整后的蜡块粘在木块上修正的目的： 1.使切成的蜡带
21、成一直线而不发生弯曲，为此须将石蜡块削面之长边（与切削刀片刀刃平等的两边）与宽边保持在 32 的比例。2.为便于镜检和连续切片，每个切片中组织的距离要接近。因此需将组织块上下、左右的多余蜡块削去。但在修整时必须不要太靠近组织，以免将组织裸露在外造成切片易破碎的不良后果。2.8 切片切片的主要用具为切片机，切片机根据性能不同，可分为两大类：滑走式切片机和旋转式切片机。滑走式切片机的夹刀部分是滑动的，夹物部分只可上下升降，切片厚薄可调节在 240 微米之间。它不仅可以切一般未包埋的材料，也可以用作火棉胶切片、冰冻切片和石蜡切片，其缺点是不能作连续切片，所以石蜡切片一般不在这种机上进行。旋转式切片机
22、的夹物部分是上下移动和前后推进的，而夹刀部分则固定不动。这种切片机最薄的可切成 2 微米。它最适合于石蜡切处。切片机上非常重要的工具是切片刀，切片刀通常可分为三型：（1）双平面刀刃的两面平直，适用于滑走切处机和旋转式切片机（2）平凹面刀? 刀的一面平直，一面内凹，凹度深者适用于滑走式切片机，凹度浅者适用于旋转式切片机。 （3）双凹面刀，一般切片机不常采用。切片刀应注意保护刀口，防止触及坚硬物体。使用完毕后，应用棉花球蘸酒精将刀面擦拭干净，如粘有石蜡，应用氯仿和二甲苯擦拭干净，长时间不用，应在刀面和刀口涂上凡士林或液体石蜡。切片方法：将粘有蜡块的木块固定在切片机的载物台上，调整切片厚度 18微米
23、，安装好切片刀，调整刀口与石蜡块的角度和位置。石蜡的切面和下边应与刀口平行。刀片和石蜡块应成为一定的倾角，一般凹度浅的平凹刀以 46为宜，如为双平面刀，倾角大约为 15左右。一切调整好以后，就可以进行切9片了，摇动旋转轮柄，摇动一转，就可切下一片，连续摇转，就可以得到连续的切片，这就是蜡带。待蜡带到 10 厘米长时，用毛笔轻轻地将蜡带挑起，靠刀口的光滑面朝下，较皱的一面向上放置在蜡光纸上。2.9 染色烤片结束后，就可以对切片进行染色。但由于染色剂一般为水溶性或酒精溶性的，与石蜡不能互溶，所以，在染色之前，应进行脱蜡和酒精复水工作，才能进行染色。脱蜡与复水将烤干的石蜡切处置于盛有二甲苯的容器内，
24、溶掉其上的石蜡，须 5 分钟。脱蜡的快慢与室内温度有关，室温高时脱蜡就快，反之则慢。植物切片常用一级纯二甲苯和一级 1/2 二甲苯与 1/2 无水酒精混合液，每级 5 分钟左右。将经过脱蜡的切片放入、100%、95%、85%、70%、50%、30%各级酒精（每级35 分钟） 。逐渐增加切片中的含水量，最后用蒸馏水浸洗，这一过程称为复水。但复水不一定要下降到蒸馏水，这要视染液的酒精浓度，如染液用 50%酒精配制，那么切片复水至 50%酒精就可以了 切片在二甲苯中脱蜡 下降至 50%酒精中（5 分钟）1%番红溶液(2 小时)70%酒精（5 分钟）85%酒精 凉干，烘干（自然条件下）（10 秒） 0
25、.5%固绿 封藏（10 秒） （5 分钟）95%酒精 加拿大树胶（10 秒） （30 秒）100%酒精() 二甲苯()（10 秒） （5 分钟）100%酒精() 1/3 乙醇+2/3 二甲苯10（10 秒） （5 分钟） （5 分钟）2/3 乙醇+1/3 二甲苯 1/2 乙醇+1/2 二甲苯2.10 封藏制片的最后一布为封藏，其目的有两个：1、将完成的制片过程的材料用封藏剂封固以便长期保存。2、应用适合折光率的封藏剂使材料能在显微镜下很清晰的显示出来。2.10.1 封藏剂一、加拿大树胶 二、达马树胶 三、乳酸加拿大树胶为黄色，能溶于二甲苯，叔丁醇，氯仿。但经常以二甲苯为溶媒，其浓度以玻棒一端形
26、成小滴滴下，而不生成丝状为佳，加拿大树胶为最常用的封藏剂，其优点是：其折光率与玻璃的很接近，而已封藏组织又不相似，因此观察所封切片较为清晰。2.10.2 封藏法封固时先将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上,随后缓慢放下并将空气完全排除,避免水蒸气进入 。为增加切片的透明度，防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点，所以我们规定切片必须湿封，不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节，封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片取出待封，以免切片“还潮” ，形成透明不佳,出现云雾状水珠。封固剂要浓度适当,封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满
27、盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖，也不能有气泡。最后，粘贴标签，标签必须贴于玻片左侧，标签编号最好打印的2.11 烘片将封藏好的装片正面朝上，放在干净的玻璃上自然风干。3. 讨论与探究我们小组的实验最终是失败了，我们所观察到得香樟经尖的细胞是离散的，细胞被破换的非常严重。在小组所有成员对所有步骤的回忆和思考中我们一致得出结论，在其它步骤中都做得比较完美，最终导致失败的主要在于渗蜡的过程中，温箱的温度过高，直接把细胞结构破坏了，使其细胞结构不完整。还有11在于染色的时候染的时间太长，导致看的不是很清楚。还有我们在贴片的时候使用镊子力度有点过大，这也是实验不成功的一点原因。最重要的一点还
28、是我们对整个实验的流程不是很熟悉，在许多方面我们都不懂得变通，所以我们所观察的现象和应有的结论相差甚远，在此实验中我们也学会了做任何事情都要仔细，一步一步的走踏实，一步错，就没有什么挽回的余地了。显微技术在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生物学及孢粉学发展中，已成为一个主要研究手段。石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成 1 个周期，但切片可长期保存，供教学、科研及病理诊断及复察，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。电子显微镜的发明促使生物学中微观现象的研究从显微水平发展到超显微水平。超微结构的研究结合生物化学的研究，使以形态描述为主的细胞学发展成为以研究细胞的生命活动基本规律
29、为目的细胞生物学。而生物显微制片技术能够很好的保持细胞结构形态，能很好的让人们认识到各种细胞的形态结构而进行探究。在制片技术上任存在许多的不足点，都有待学生们不不断的通过实验来完善。通过了解香樟的结构我们可以探究香樟对人体的影响，我们可以探究如果香樟用来做家俱或者大面积的种植所带来的不同效果。目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段，许多技术应用环节尚需进一步摸索。12参考文献1、 生物显微技术李晓宏教授编，咸宁职业技术学院2、 生物显微技术 郑国倡编 人民教育出版社 1979 年出版.3、 显微镜标本的制作法田中克己著 科学出版社 1961 年出版 .4、 组织学标本制作技术湖北医学院组织胚胎学教研室 . 5、生物显微制片取材的探讨 孙红祥 现代应用药学.1992,9(6).-264-265,275.13致谢在本实验中，真挚的感谢李晓宏教授的亲切辅导和焦晓飞老师的指导，还有小组其他成员的团结合作、彼此之间的相互信任。在李晓宏教授极强的专业指导下，我们深受他严谨的作风和对实验的负责态度影响，在此，特此向您敬礼。在您的指导下我们才能完成该实验。最后，谨向本论文所参阅的所有文献资料的编著者表示谢意，您们的工作为本项目奠定了基础14
