1、1附录 V F 电泳法第六法 等电聚焦水平板电泳法两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。1. 仪器装置 恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。2. 试剂（1）水 （电阻率应不低于 18Mcm）（2）A 液 称取丙烯酰胺 5.0g，亚甲基双丙烯酰胺 0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。（3）B 液 10过硫酸铵溶液，新鲜配
2、制。（4）甲基红试液 称取 5mg 甲基红，溶于 10mL 0.05mol/L 氢氧化钠中。（5）50%甘油（6）正极液 0.5mol/L 磷酸溶液（7）负极液 1mol/L 氢氧化钠溶液3. 操作法 （1）制胶 取 A 液 2.5ml，pH310 的两性电解质（或其它 pH 范围的两性电解质）0.35ml，水 1.25ml，50%甘油 0.5ml，抽气 510 分钟，加 B 液 25l，N,N,N,N-四甲基乙二胺 6l，混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合。（2）预电泳 将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条
3、，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压 200V 下预电泳30 分钟。（3）对照品溶液和供试品溶液的制备 将供试品对水透析（或用其它方法）脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至 0.55mg/ml（如供试品蛋白或多肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩） 。对照品溶液同供试品溶液制备。（4）电泳 将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液 520l。选择恒压方式进行电泳，起始电压为 200V。电泳 0.51 小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至 400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至 600V，待电流不再变化时停止电泳
4、。4. 固定和染色（1）试剂 a. 固定液 20三氯醋酸b. 染色液 i) 染色储备液 称取 1.0gG-250，溶于 20ml 水中，为溶液 1；称取125g（NH 4） 2SO4，溶于 400ml 水中，为溶液 2；称取 20g H3PO4，为溶液 3；将溶液 3 加入到溶液 1 中，待 G-250 完全溶解后 ，与溶液 2 混合，并加水至 1L，混匀后即得，用前2应充分混合。ii) 工作染色液 取 60ml 染色储备液，与 30ml 甲醇混匀，新鲜配制。c. 脱色液 蒸馏水（2）固定与染色 电泳完毕后，取出胶片，置于固定液中固定 20 分钟以上，取出胶片，置染色液中 3 小时，用脱色液脱色至背景透明后取出晾干，亦可做成干胶永久保存。5. 结果判断将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描，通过扫描定位法测量蛋白质或多肽与等电点标准的迁移距离。（1）鉴别 供试品主成分迁移位置应与对照品迁移位置一致。（2）等电点 以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点（pI）对其相应的迁移距离直线回归作图；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
