1、第八章抗生素类药物的分析一、效价的测定方法:1、稀释法:原理:用液体培养基逐级 将抗生素稀释,在各管中加入等量的试验菌液,进行培养,观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度,再与同法测定的标准品终点作比较,从而求得被测抗生素的效价。X=(T/S)*C X 样品效价(U/ml) T 检品液最大稀释倍数S 标准品液最大稀释倍数 C 标准品液效价(U/ml)检测终点判断 1、试验菌生长完全抑制 2、生长 50%抑制3、指示剂变色 4、电位差的改变5、菌种的溶血现象等2、比浊法 原理:将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内,混匀后,经短期培养(约 3-4h) ,测量培养基浊度,其浊度与细菌数、细菌
2、群体质量存在直接关系,在一定的范围内符合比耳定律。影响因素1) 物理因素:1、散射现象 2、菌液浓度: 3、细菌体大小的变化2) 培养基:成分、酸度、培养温度、通气等条件影响。金黄色葡萄球菌,pH 在 6.8-7.8。3) 培养:温度、振摇。3、琼脂扩散法即管碟法 原理: 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散,形成一定浓度抗生素的球型区,抑制试验菌生长,通过透明培养基观察抑菌圈,抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较;当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时,标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应
3、曲线,在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理,可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价公式里各字母意义要记下。影响抑菌圈半径的因素:(1)D 的影响因素:抗生素本身结构、分子量等杂质:琼脂含量:菌种对抗生素的吸附作用:pH 影响分子的形式、温度影响扩散D 增大,r 也增大(2)T 的影响: 一般 T 增加,r 增大。(3)M 的影响:在一定的范围内,小管内 M 越大,抑菌圈直径越大。(4)C 的影响: C 越小,抑菌圈直径越大(5)H 的影响:培养基增厚,则抑菌圈减小。操作步骤:1、 试验菌的纯化与悬液的制备 2 、缓冲液、灭菌水与培养基的制备3 、标准品、供
4、试品的称量、溶解与稀释4 、双碟的制备及放管)4log(l21.9DTHCMDTr5 、滴加药液6 、恒温培养7 、测量抑菌圈直径或面积8 、计算二、可靠性测验: 通过统计各组均数间的方差,以试品间、回归、剂间(列) 、碟间(行)的方差与误差项(S2)的比值(称 F 值) ,来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性。F 值(F 值=该项方差/误差项 S2)可作为观察实验显著性程度的一个指标试品间差异不显著(P0.05)回归项非常显著(P0.05)剂间差异显著(P0.05)三、链霉素呈色反应:1、茚三酮反应:蓝紫色化合物2、坂口反应(sagaguchi test):链霉素水解产物链霉胍特有。
5、链霉胍,8-羟喹啉分别与次溴酸钠反应,其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。3、糖类反应:莫利西反应(Molisch test),五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成羟甲基糠醛,与蒽酮显蓝色,与 -奈酚呈红紫色 。OHO2CCHOO OCH2OCH2 OOHO2CCHOOH OHO2CCH OHOH4、埃尔松-摩根(Elson-Morgan test):样品在强酸或强碱水解后释放出氨基己糖,在碱性条件下与乙酰丙酮缩合,形成吡咯的衍生物,在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液(Ehrlich 试剂)成红色,在 540nm 处可定量测定。5、麦芽酚反应(maltol test):链霉素
6、在碱性溶液中水解,重排,生成麦芽酚在酸性溶液中与三价铁离子结合,形成紫红色络合物。四、四环素类抗生素(了解)(一)呈色反应1、浓硫酸反应 四环素 深紫色; 金霉素 蓝色至绿色;土霉素 朱红色; 强力霉素 黄色;2、三氯化铁反应:含有酚羟基,遇三氯化铁立即呈色反应,(二)荧光反应:土霉素绿色荧光,四环素黄色荧光 (三)紫外光谱(四)色谱五、大环内酯抗生素(了解)(一)呈色反应1、硫酸反应:遇硫酸均呈红棕色 2、莫利西反应:糖类的反应3、Seliwanaff 反应:脱水 间苯二酚糖 糖醛衍生物 具颜色产物 红霉素 淡黄色; 螺旋霉素 亮紫红色;碳霉素 深青紫色; 柱晶白霉素 淡青色;(二)薄层色谱
7、(三) 光谱学鉴别紫外光谱红外光谱六、利福霉素类抗生素(了解)呈色反应:1 、浓盐酸反应:2 、三氯化铁:向 1ml 利福霉素的溶液中,滴加三氯化铁乙醇溶液,有绿色,蓝绿色。表明有酚羟基3 、硝酸盐反应:利福平,溶液中加入硝酸钠溶液,颜色由橙色变为暗红色。七、杂质检查1、青霉素 过敏原:青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白(青霉噻唑基团)凝胶过滤法分离,用 Penamaldate 法测定HgCl2青霉噻唑衍生物 Penamaldate 衍生物(285nm)2、链霉素毒性杂质:链霉胍,链胍双氢链糖;双氢链霉素;链霉素醛基化合物;神经毒性:二链霉胺二链霉胺含量测定原理:二链霉胺等不被 KBH4 还原,能与盐
8、酸氨基脲反应,生成的缩氨脲在 233nm有吸收峰3、四环素杂质: 脱水四环素、差向四环素、差向脱水四环素(HPLC 测定)4、土霉素杂质: 脱水土霉素、差向土霉素、-阿扑土霉素、 - 阿扑土霉素等降解产物.( 薄层分离,荧光测定)第九章 维生素及辅酶类药物分析一、维生素 C 类的分析1、性质1) 酸性 :烯二醇结构酸性。一元酸. 能与 NaHCO3 作用生成钠 盐 C3-OH, pKa=4.7(共轭效应) C2-OH,pKa=11.57(邻位羰基) 2) 还原性 :烯二醇基还原性。 与硝酸银反应可生成金属银黑色沉淀与 2,6-二氯吲哚酚反应(2,6-二氯靛酚)3) 荧光反应:4) 糖的性质 :
9、 VC 的结构很象糖结构,具有糖的性质。可在三氯醋酸或盐酸存在下,经水解、脱羧、失水等反应,转变为糠醛,再与吡咯在 50反应生成蓝色,用于鉴别反应2、鉴别:1) 还原性:维生素 C 分子中的二个烯醇基具有强还原性可以被氧化为二酮基2) 利用糖类的性质 可在三氯醋酸或盐酸存在下,经水解、脱羧、失水等反应,转变成糠醛,再与吡咯在 50反应生成蓝色。3) 紫外分光光度法:根据维生素 C 在盐酸液(0.01mol/L)中,243nm 有最大吸收3、含量测定1) 碘量法:维生素 C 由于分子中的烯二醇基具有还原性,能被 I2 氧化成二酮基.1mol 维生素 C与 1mol I2 定量反应. 终点颜色:无
10、色蓝色。反应条件 :酸性 使 VC 在空气中氧化速度减慢。 溶剂 新沸放冷的水。 减少水中溶解氧的影响要排除亚硫酸的影响则在滴定前加入丙酮或甲醛。2) 2,6-二氯靛酚滴定法 原理: 在酸性下 ,维生素 C 氧化型是 红色的;还原型是无色的 .酸性下直接用 2,6-二氯靛酚滴定,用滴定剂自身的颜色变化指示终点,不需要另外的指示剂。3) 与 1,10-菲洛啉-铁(III)试剂的比色法基于维生素 C 将 Fe()还原生成 Fe(),Fe()与菲洛啉 形成桔红色络合物,在 510nm 有最大吸收。4) 紫外分光光度法二、维生素 E 的分析合成型为 dl-生育酚醋酸酯天然型为 d-生育酚醋酸酯检查:天
11、然维生素 E 采用硫酸铈滴定法检查游离生育酚。游离生育具有还原性,可被硫酸铈定量氧化取本品 0.10g,加无水乙醇 5ml 溶解后,加二苯胺试液 1 滴,用硫酸铈滴定(0.01mol/L)滴定(黄色) ,消耗硫酸铈滴定液(0.01mol/L)不得过 1.0ml。每 1ml 硫酸铈滴定液(0.01mol/L)相当于 0.002154g 的游离生育酚,维生素 E 中所含的游离生育酚的限量相当于不得过 2.15。三、辅酶 Q10 的分析1、鉴别1) 根据氧化型和还原型颜色不同来鉴别氧化型辅酶 Q10 还原型辅酶 Q10(黄色) (无色) 2) 氧化型辅酶 Q10 可将还原型亚甲蓝(无色)氧化而显蓝3
12、) 紫外吸收光谱,275nm 第十章 核苷酸类药物分析一、嘌呤类核苷酸药物分析1、鉴别定糖法 地衣酚 orcinol 反应:核酸与浓盐酸共热时,可形成糠醛(绿色 670nm)二苯胺反应:脱氧核糖核酸经酸水解后得脱氧核糖(蓝色 595nm)间苯三酚反应:其中的核糖在水溶液中加间苯三酚,水浴,显玫瑰红色第十三章酶类药物的分析一、 酶活力测定方法1) 固定时间法 在适宜的条件下,使酶和底物共同保温一定时间,测定产物生成的量或底物消耗的量,计算出酶的含量(或活力) 。E表示酶浓度,P为反应产物浓度,t 表示酶作用时间,K 为常数。2) 连续监测法 在酶反应过程中,连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成
13、量。 (一) 、需 NAD+或 NADP+作指示的连续监测法还原型辅酶(NADH 和 NADPH)在 340nm 处有紫外吸收,氧化型辅酶(NAD+和NADP+)在 340nm 处无紫外吸收.利用 340nm 处每分钟吸收度升高或降低的速率与酶活性成正比的关系,推算出酶的活力单位。包括: 直接测定法 : 大多数需 NADH(NADPH)参加的脱氢酶,可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在 340nm 处吸收度的变化,计算酶活力单位。丙酮酸NADHH+ 乳酸NAD+ 340nm 处吸收度降低的速率与 NADH 的氧化速率成正比,与 LDH 的活力成正比。偶联法: 此类酶催化反应不需 NAD+或
14、NADP+,但当与需 NAD+或 NADP+的脱氢酶反应偶联以后,能用紫外分光光度法测定.由脱氢酶引起的反应为指示反应,脱氢酶是指示酶,指示酶活力要比测定酶活力至少大 100 倍。例如:谷草转氨酶的测定:三联酶活测定: 引入一个辅助酶反应,将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来,组成一个“三合一”酶反应系统,使底物转化率、辅助酶反应和 NADH(NADPH)氧化速率之间成正比函数关系,辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。例如:磷酸肌酸+ADP 肌酸ATP (1)葡萄糖ATP G-6-P ADP (2)G-6-P + NADP+ 葡萄糖酸-6-磷酸 NADPH H+ (3) (1) 被
15、测反应,(2)辅助反应,HK(己糖激酶)辅助酶,(3) 指示反应, G-6-PDH(6磷酸葡萄糖脱氢酶)指示酶。(二) 、不需 NAD+或 NADP+作指示的连续监测法3) 固定浓度法根据酶催化反应,使反应产物达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的. P=KEt以所需时间的倒数(1/t)对酶浓度作图即可制备标准曲线。优点:1、记录时间。2、准确二、 酶活性测定方法的设计一、 正交设计多因素选择正交试验设计(Orthogonal experimental design)是一种高效的利用正交表来安排多因素多水平设计试验的方法。通过巧妙的安排和分组,用较少的试验次数,就能分析各因素
16、的作用大小,找出最佳的试验条件。利用各因素所对应指标的极差 R 及平均极差 D 作出判断。正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件:中性蛋白酶是一种蛋白水解酶,活力测定以酪蛋白为底物,水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质,于 680nm 处测定吸收值。中性蛋白酶作用受缓冲液的 pH 值、底物浓度、反应时间及酶浓度等因素的影响。供试品:0.01% 的中性蛋白酶溶液。底物:酪蛋白实验方案实验取四个因素: PH 值、底物浓度、反应时间、酶浓度。每个因素选三水平,属于多因素多水平,为此选用 L9(34 )正交表进行实验。正交试验表正交实验安排表各因素试验值计算结果平均极差越大,对应的因素影响越大。
17、缓冲液 PH 值 7.2,底物浓度 0.5%,酶浓度用 100U/ml 为最佳反应条件。实验号 A缓冲液 pH 值B底物浓度(%)C反应时间(min)D酶浓度(U/ml)1 1 1 1 12 1 2 2 23 1 3 3 34 2 1 2 35 2 2 3 16 2 3 1 27 3 1 3 28 3 2 1 39 3 3 2 1反应时间为 10,20,30min ,对 OD 值无显著影响。各因素试验值的方差分析结论:PH 值(A) 、底物浓度(B) 、酶浓度( D)为非常显著因子;反应时间(C)为非显著因子。三、酶类药物的检测1. 肽键水解酶1) 胰蛋白酶: 由动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶
18、。原理:胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键、酰胺键及酯键,水解速度为酯键酰胺键肽键。BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)苯甲酰L精氨酸乙酯(BAEE)在胰蛋白酶的作用下,酯键被水解生成苯甲酰L精氨酸,在 253nm 波长处的吸收度随酶促反应递增,因此连续记录不同时间的产物生产量,根据活力单位定义计算酶活力。测定法:取呈直线的吸收度,按下式计算:P 为 每 mg 供试品含胰蛋白酶的单位,U;A1 为直线上终止的吸收度;A2 为直线上开始的吸收度;T 为 A1 至 A2 读数的时
19、间,min;W 为测定液中供试品的量,mg ;吸收度每分钟改变 0.003,即相当于 1 个胰蛋白酶单位 。2) 弹性蛋白酶测定原理: 刚果红弹性蛋白法:以刚果红弹性蛋白为底物,由于刚果红弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解,根据刚果红在 495nm 处有最大吸收,由标准曲线即可查得弹性酶单位数。单位:20 分钟水解 1mg 刚果红弹性蛋白 所需的酶量为 一个弹性酶活力单位。方法:3) 尿激酶效价测定原理(气泡上升法): 尿激酶激活人体内 纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶;纤维蛋白原在凝血酶的作用下,转变成纤维蛋白凝块,此凝块在纤维蛋白溶酶作用下,水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量
20、的情况下,尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。操作(气泡上升法)试管中加纤维蛋白原溶液 0.3ml(37水浴)标准品(或供试品) 1.0ml加混合溶液 0.4ml立即摇匀计时,反应系统应在 3045 秒内凝结,当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。以尿激酶的浓度为横坐标,以反应时间的对数为纵坐标。b2. 脂键水解酶胰脂肪酶(Pancreatic Lipase )原理:胰脂肪酶是一种水解酶,在一定条件下把甘油三脂类脂肪水解,最后生成甘油及脂肪酸。底物:橄榄油用已知浓度的标准碱溶液滴定,可定量地测定脂肪酸的量,从而得知脂肪酶活力。测定步骤:计算: 每分钟水解橄榄油产生 1m
21、ol 脂肪酸的酶量,为 1 个活力单位。每克含有的胰脂肪酶单位A:供试品消耗 NaOH (0.1mol/L)的体积B:空白消耗 NaOH (0.1mol/L)的体积W:供试品取样量(g)N:供试品稀释倍数。3. 糖苷键水解酶 溶菌酶效价测定比浊法: 以溶酶小球菌为底物,主要成分为粘多糖,粘多糖由 NAG 和 NAM 重复而成。只能水解 NAM C1 和 NAG C4 之间的 1,4 糖苷键。溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后,导致溶菌,溶液的吸收度下降。在一定的条件下,每分钟吸收度下降 0.001 为一个酶活力单位。计算:酶活力单位(u/mg)= W 为测试液中供试品的重量(g )测定
22、溶菌酶活性-比色法 : 用染料艳红 K2BP 标记的 M.Lysodeikticus 为底物,酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片(产物)反应后离心除去未分解底物,上清液比色,吸收度为溶菌酶活力的函数。4. 超氧化物歧化酶效价测定: SOD 测定方法:间接法:使用氧自由基指示清除剂, SOD 与指示清除剂竞争 O2- ,从而抑制指示清除剂与O2- 的结合,根据指示清除剂与 O2- 反应速度的变化可间接测定 SOD 的活性。包括:黄嘌呤氧化酶细胞色素 C 法和邻苯三酚法。1) 黄嘌呤氧化酶细胞色素 C 法:原理:在有氧条件下,黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸,与此同时产生 O2- ,氧化型细胞色素 C
23、 被 O2- 还原为还原型细胞色素 C,后者在 550nm 有最大吸收,因此测定氧化性细胞色素 C 在加入 SOD 前后的光吸收变化可间接计算酶活性。方法:注意点: 在特定条件下,25 (pH7.8)每分钟抑制细胞色素 C 还原速率达 50所需要的酶量为一个活力单位。重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活,因此反应体系中必须添加 EDTA。反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素 C 发生过氧化作用,从而干扰检测的正确。2) 邻苯三酚法:原理:在碱性条件下,邻苯三酚会发生自氧化生成红 酚,同时生成 O2- ,当有 SOD 存在时由于它能催化 O2- 与 H+结合生成 O2 和 H2O2,从而阻止了中
24、间产物的积累。定义:在一定条件下,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50的酶量为一个酶活力单位。操作:定义:在一定条件下,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50的酶量为一个酶活力单位。5. 门冬酰胺酶原理:测定步骤:在上述规定条件下,每分钟催化 L-门冬酰胺水解释放 1g 分子氨所需的酶量定义为 1 个酶活力单位.比活力测定方法:采用 Lowry 法测定蛋白质含量,比活力=酶活力(U)/ 蛋白含量(mg)。6. 天冬氨酸酶活力的测定一个酶活力单位定义为在测定条件下,每小时每克细胞转化生成 1mol 天冬氨酸所需的酶量.第十四章 多糖类药物分析一、多糖的分子量测定1、凝胶色谱法 :将分子量不同的蛋白
25、质通过一定孔径的凝胶固定相,由于各组分流经体积的差异,使不同分子量的组分得以分离。最先淋出的是最大的分子。Kd = 0, Ve= V0 ;Kd = 1 , Ve= V0+Vi ;0Kd1,Ve=V0+KdVi2、粘度法3、超离心法4、高效液相色谱色谱条件: 凝胶柱(分子量大小) , 示差折光检测器。 标准曲线:标准曲线:LogMW = a+b tRMW 为重均分子量,tR 为保留时间待测多糖分子量(GPC 专用软件)重均分子量 Mw=(RIiMi)/ RIiMi 为供试品在保留时间 ti 时的分子量, RIi 在第 i 部分中被洗脱物质的量(重量) 。 二、多糖的含量测定1、比色法(硫酸咔唑法
26、、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法)1) 硫酸咔唑法: 己糖醛酸测定在浓硫酸中,己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。 520nm 比色2) 乙酰丙酮法:氨基己糖氨基己糖在碱性条件下加热,可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物,该衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应,反应物呈红色,于 525nm 测定吸收度。3) 硫酸苯酚法:测定糖含量(总糖)原理:多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,该单糖在强酸性条件下,与苯酚反应生成橙色衍生物。在 490nm 处有最大吸收,其吸光度与浓度呈线性关系。4) 蒽酮法: 测定糖含量(总糖)原理:多糖在浓硫酸中水解后,进一步脱水生产糠醛类衍生物,与蒽酮作用形成蓝色化合物,620nm 进
27、行比色测定。特点:10-100g 范围内其颜色的深浅与糖含量成正比。灵敏度高。2、生物测定法(肝素钠)3、生色底物法(低分子量肝素钠) 当蛋白酶(Fa)从生色底物分裂出 pNA 时,发色物的产生量与剩余的酶量成正比,与肝素效价成反比。405 nm 测定。三、多糖类药物结构分析1、单糖组成多糖组成单糖的分析水解方法(1) 、完全酸水解法: 水解难易取决单糖性质及构型。呋喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解, 型较 型易水解。(2) 、部分酸水解、碱水解: 选择温和的条件水解多糖, 使糖链中某种类型的键特异性地打断(3) 、乙酰解: 多糖经过乙酰解反应(醋酐、冰醋酸)可生成乙酰化单糖和寡糖(4) 、甲醇
28、解: 多糖链在 80100条件下与无水甲醇反应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物,进行气相色谱分析(5) 、酶降解: 分为外切糖苷酶和内切糖苷酶外切糖苷酶:切下多糖非还原末端的一个单糖,并对单糖组成和糖苷键有专一性要求。内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键,释放多糖链片断以利于结构分析。鉴定: 气相色谱法高效液相色谱法气相色谱法与质谱分析连用2、糖苷键连接方式1) 红外光谱糖苷键类型确定吡喃糖糖苷键时,用红外光谱,在 890cm-1 处有特征吸收者,示有 -型糖苷键,在840cm-1 处有特征吸收者,示有 -型糖苷键。2) 核磁共振谱糖苷键( 型或 型) 。H-NMR 谱中的化学位移 5.4 和 5.1 ,有两个信号说明分子结构中的糖苷键为 型,如有 4.53 说明有 型。3、糖苷键连接位置(一) 、高碘酸氧化、Smith 降解原理:选择性的氧化降解反应,能够作用于多糖分子中 1,2二羟基和 1,2,3三羟基,生成过碘酸氧化产物;此产物用硼氢化钠还原后,再用酸水解,生成相应的醛、甲酸。室温下用稀无机酸水解还原产物。(二) 、甲基化反应产物分析(三) 、乙酰解后质谱分析第十二章 多肽药物分析(该章节未划重点)