1、实验 1 红细胞与白细胞的计数（必修）目的与原理掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方 mm 血液中红、白细胞个数。实验对象 鲤、鲫或草鱼。试剂与器材显微镜，血细胞计数板 29，计数器 29，鱼用注射器（1ml 或 5ml，6 号针头） ，吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管（14 个）及试管架（7 个） ，移液管（1
2、ml 及 2ml，各 7 个） ，红、白细胞稀释液（或 0.850.9%的 NaCl 溶液） ，75% 的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或 10%草酸钾溶液） 。实验步骤1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图 1-5-1） 。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成 9 个大方格（图 1-5-2） 。大方格每边长 1.0mm。四角的大方格每个又分为 16 个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成 25 个中方格，每个中方格又等分
3、成 16 个小方格（用单线） ，中方格每边长为 0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的 5 个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图 1-5-2） 。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为 0.1mm，此为计数室的高度。2、采血及稀释：以 2ml 移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或 0.850.9%的 NaCl 溶液2ml，另用 1ml 移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液 0.38ml，备用。图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺
4、势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取 10l 血液至红细胞稀释液试管内，再吸取 20l 血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗 23 次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。4、计数：
5、稀释血液滴入计数室后，须静置 23 分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗） 。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共 5 个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图 1-5-3） 。计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差 10 个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过 15 个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。5计算红细胞数目：将 5 个
6、中方格内数得的红细胞总数乘以10，000即得每立方 mm 血液中红细胞总数。图 1-5-3 血细胞计数方式（实心圈表示计数的红细胞，空心圈表示不应计数的红细胞）计算公式为：红细胞数/ mm3 = 5 个中格红细胞数稀释倍数/计数的 5 个中格容积（1） 稀释倍数等于稀释液 2ml 除以加入血 10L（0.01ml） ，为 200 倍。（2） 计数室 5 个中格容积为 0.20.20.15 = 0.02 mm3。白细胞数目：将 4 个大方格内数得白细胞总数乘以 50，即每立方 mm 血液的白细胞总数。计算公式为：白细胞数/ mm3 = 4 个大方格白细胞数稀释倍数/ 计数的 4 个大格容积（1）
7、 稀释倍数等于稀释液 0.38ml+血 20L（0.02ml ）/0.02ml ，为 20 倍。（2） 计数室 4 个大方格容积为 110.14= 0.4 mm3。注意事项1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次） 95%酒精（两次） 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。附 血细胞稀释液1、白细胞稀释液冰醋酸（破坏红细胞） 1.5 毫升1%龙胆紫（染白细胞核便于计数） 1 毫升蒸馏水 加至 100 毫升2、红细胞稀释液NaCl (维持渗透压 ) 0.5 克Na2SO4 (使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉) 2.5 克HgCl （固定红细胞形状） 0.25 克蒸馏水 加至 100 毫升
