1、包涵体的变性及复性1、用1Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后， 获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的 1Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，加入用1Binding Buffer 配制的 0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用 1Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1Binding Buffer 进行4透析复性，每 2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白
2、液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠 中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的
3、转变，从而促进复性的进行。3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP） ，是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如 t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。8
4、、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。10、复性缓冲液的 pH 值必须在 7.0 以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性 pH值一般是 8.0-9.0。11、要是你的目标蛋白中含有二硫键的话，透析液中也必须添加一定比例的GSSG/GSH以协助二硫键的正确形成，这在蛋白质重折叠过程中是至关重要的1. 变性 包涵体变性的常用方法是通过采用较为温和的变性剂，如脲、盐酸胍和十二烷基肌氨酸钠等来溶解包涵体。溶解前可用一些表面活性剂，如脱氧
5、胆酸钠、SDS、TritonX-100 等洗涤包涵体以除去杂质和可溶性杂蛋白。变性剂的使用浓度需做实验后根据包涵体的溶解情况来决定。一般脲的最高使用浓度可到 8mol/L，盐酸胍的最高使用浓度可到 7 mol/L。溶解包涵体的时间也需根据实验来定，一般情况需用 1-3 天不等。溶解可在室温进行。对于含有两对二硫键以上的蛋白质，应在变性液中加入还原剂防止错配二硫键的产生。常用的还原剂有二硫苏糖醇（使用浓度为 1-50mmol/L）、- 巯基乙醇（使用浓度为 0.5-50mmol/）、还原性谷胱甘肽（使用浓度为 1-50mmol/L）。还原剂可将二硫键还原为巯基以起到保护作用。2. 复性 当包涵体
6、溶解以后，就可以进行复性。复性的主要方法是稀释和透析，或者两种方法合并使用。另外也可在凝胶柱上复性。复性时应注意下述几点： 复性蛋白质的浓度 控制复性时蛋白质溶液的浓度关系到复性效率的高低，一般浓度应小于 0.1mg/ml，浓度过高会引起沉淀产生，反而不利于复性的进行。 透析液的 pH 选择透析液 pH 值时，应避免在蛋白质的等电点处，选定的 pH 值应能使蛋白质保持稳定。 氧化剂 复性时透析液中应加入氧化剂，如氧化型谷胱甘肽等，使复性蛋白质含有的巯基在透析时被氧化为正确的二硫键。 温度 复性时的温度一般应在 4，有时也可在室温进行。这取决于蛋白质的性质。溶解的包涵体复性时，常常会产生沉淀。这是由于当变性剂除去的时候，蛋白质会重新聚合为多聚体而形成沉淀。所以，如能将复性过程置于复性临界点之上方能获得最佳的复性效果。要做到这一点，必须在实验中不断摸索。一般包涵体的复性率多在20% 以下。复性后的蛋白质仅仅是初步纯化的蛋白质，还需经过进一步的分离纯化才能获得纯品。
