1、1猪瘟防治技术规范猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。为及时、有效地预防、控制和扑灭猪瘟，依据中华人民共和国动物防疫法、 重大 动物疫情应急条例和国家突发重大动物疫情应急预案及有关的法律法规，制定本规范。1 适用范围本规范规定了猪瘟的诊断、疫情报告、疫情处置、疫情监测、预防措施、控制和消灭标准、控制和消灭标准等。本规范适用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）的饲养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的
2、单位和个人。2 诊断依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需做病原分离与鉴定。2.1 流行特点猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播，人、其它动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔猪发病或产生免疫耐受。2.2 临床症状22.2.1 本规范规定本病潜伏期为 3-10 天，隐 性感染可长期带毒。根据临床症状可将
3、本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种类型。2.2.2 典型症状2.2.2.1 发病急、死亡率高；2.2.2.2 体温通常升至 41以上、厌食、畏寒；2.2.2.3 先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；2.2.2.4 腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内 侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。2.3 病理变化2.3.1 淋巴结水肿、出血，呈现大理石样变；2.3.2 肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；2.3.3 全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑，脾脏边缘 出现梗死灶；2.3.4 脾不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死；2.3.5 慢性猪瘟在回
4、肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状” 溃疡。2.4 实验室诊断实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。2.4.1 病原分离与鉴定2.4.1.1 病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件 1）；2.4.1.2 病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现特异性的荧光（见附件 2）；2.4.1.3 兔体交互免疫试验（附件 3）；2.4.1.4 猪瘟病毒反 转录聚合酶链式反应（RT-PCR ）：主要用于临床诊3断与病原监测（见附件 4）。2.4.1.5 猪瘟抗原双抗体夹心 ELISA 检测法：主要用于临床诊断与病原监测（见附件 5）。2.4.2 血清学检测2.4.2.1 猪瘟病毒抗体阻断 EL
5、ISA 检测法（见附件 6）；2.4.2.2 猪瘟荧光抗体病毒中和试验（见附件 7）： 2.4.2.3 猪瘟中和试验方法（见附件 8）。2.5 结果判定2.5.1 疑似猪瘟符合2221，2222，2223，2224，231，232，233，234之一的。猪瘟流行病学特点、临床症状和病理变化。2.5.2 确诊非免疫猪符合结果判定 2.5.1，且符合血清学诊断2.4.2.1，、2.4.2.2，、2.4.2.3，之一；，或符合病原学 诊断2.4.1.1，、2.4.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5 之一的；免疫猪符合结果 2.5.1，且符合病原学诊断2.4.1.1，、2.4
6、.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5 之一的。3 疫情报告3.1 任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的猪，都应当立即向当地动物防疫监督机构报告。3.2 当地动物防疫监督机构接到报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。44 疫情处理根据流行病学、临床症状、剖检病变， 结合血清学检测做出的临床诊断结果可作为疫情处理的依据。4.1 当地县级以上动物防疫监督机构接到可疑猪瘟疫情报告后，应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状和病理变化等初步诊断为疑似猪瘟时， 应立即对病猪及同群猪采取隔离、消毒、限制移动等临时性措施。同时采集病料送省级动物防疫监督机构实验室确诊
7、，必要时将样品送国家猪瘟参考实验室确诊。4.2 确诊为猪瘟后，当地县级以上人民政府兽医主管部门应当立即划定疫点、疫区、受威胁区，并采取相 应措施；同 时，及时报请同级人民政府对疫区实行封锁，逐级上报至国务院兽医主管部门，并通报毗邻地区。国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，确认猪瘟疫情。4.2.1 划定疫点、疫区和受威胁区疫点：为病猪和带毒猪所在的地点。一般指病猪或带毒猪所在的猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点。疫区：是指疫点边缘外延 3 公里范围内区域。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等因素。受威胁区：是指疫区外延 5 公里范围内的区域。4
8、.2.2 封锁由县级以上兽医行政管理部门向本级人民政府提出启动重大动物疫情应急指挥系统、 应急预案和对疫区实行封锁的建议，有关人民政府应当立即做出决定。4.2.3 对疫点、疫区、受威胁区采取的措施5疫点：扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及其产品按照 GB16548 规定进行无害化处理；对排泄物、被污染或可能污染饲料和垫料、污水等均需 进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件 9）；限制人员出入，严禁车辆进出，严禁猪只及其产品及可能污染的物品运出。疫区：对疫区进行封锁，在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站(临时动
9、物防疫监 督检查站) ，对出入的人员和车辆进行消毒；对易感猪只实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；停止疫区内猪及其产品的交易活动，禁止易感猪只及其产品运出；对猪只排泄物、被污染饲料、 垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒。受威胁区：对易感猪只(未免或免疫未达到免疫保护水平) 实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；对猪只实行疫情监测和免疫效果监测。4.2.4 紧急监测 对疫区、受威胁区内的猪群必须进行临床检查和病原学监测。4.2.5 疫源分析与追踪调查根据流行病学调查结果，分析疫源及其可能扩散、流行的情况。对可能存在的传染源，
10、以及在疫情潜伏期和发病期间售( 运)出的猪只及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应当立即开展追踪调查，一经查明立即按照 GB16548 规定进行无害化处理。4.2.6 封锁令的解除疫点内所有病死猪、被扑杀的猪按规定进行处理，疫区内没有新的病例发生，彻底消毒 10 天后，经当地动物防疫监督机构审验合格，当地兽医主管6部门提出申请，由原封锁令发布机关解除封锁。4.2.7 疫情处理记录对处理疫情的全过程必须做好详细的记录（包括文字、图片和影像等），并归档。5 预防与控制以免疫为主，采取“ 扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。5.1 饲养管理与环境控制饲养、生产、 经营等场所必须符合动物防
11、疫条件审核管理办法（农业部200215 号令）规定的 动物防疫条件，并加强种猪调运检疫管理。5.2 消毒各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生（消毒）管理制度，做好；猪圈、加工厂、用具、车辆 、粪便、道路和人 员等应进行定期的严格消毒、杀虫、灭鼠工作（见附件 9）。5.3 免疫和净化5.3.1 免疫国家对猪瘟实行全面免疫政策。预防免疫按农业部制定的免疫方案规定的免疫程序进行。所用疫苗必须是经国务院兽医主管部门批准使用的猪瘟疫苗。5.3.2 净化对种猪场和规模养殖场的种猪定期采样进行病原学检测，对检测阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐步净化猪瘟。5.4 监测和预警5.4.
12、1 监测方法7非免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主，结合病原鉴定。免疫区域：以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测。5.4.2 监测范围、数量和时间对于各类种猪场每年要逐头监测两次；商品猪场每年监测两次，抽查比例不低于 0.1%，最低不少于 20 头；散养猪不定期抽查。或按照农业部年度监测计划执行。5.4.3 监测报告监测结果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报中国动物疫病预防控制中心。5.4.4 预警各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。5.5 消毒饲养场、屠宰厂（场）、交易市场、运 输工具等要建立并实施严格的消毒制度。5.6 检疫5.6.1
13、产地检疫生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检。动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。5.6.2 屠宰检疫动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可入厂/8场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合格的按有关规定处理。5.6.3 种猪异地调运检疫跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续， 调出地按照进行检疫，检疫合格方可调运。到达后须隔离饲养 10 天以上，由当地动物防疫监督机构检疫合格后方可投入使用。6 控制
14、和消灭标准6.1 免疫无猪瘟区6.1.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。6.1.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。6.1.3 该区域在过去 3 年内未发生过猪瘟。6.1.4 该 区域和缓冲带实施强制免疫，免疫密度 100%，所用疫苗必须符合国家兽医主管部门规定。6.1.5 该区域和缓冲带须具有运行有效的监测体系，过去 2 年内实施疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实。6.1.6 所有的报告，免疫、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。若免疫无猪瘟区内发生猪瘟时，最后一例病猪扑杀后 12 个月，经实施有效的疫情监测，确认后方可重新申请免疫无猪瘟区。6.2 非免疫无猪瘟区6.2
15、.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。6.2.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。6.2.3 在过去 2 年内没有 发生过猪瘟，并且在过去 12 个月内，没有进行过免疫接种；另外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免疫接种过的猪。96.2.4 在该区具有有效的监测体系和监测区，过去 2 年内实施疫病监测，未检出病原。6.2.5 所有的报告、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采取扑杀措施及血清学监测的情况下，最后一例病猪扑杀后 6 个月；或在采取扑杀措施、血清学监测及紧急免疫的情况下，最后一例免疫猪被屠宰 后 6 个月，经实施有效的疫情监测和血清学检测确认
16、后，方可重新申请非免疫无猪瘟区。 附件 1病毒分离鉴定采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如 PK-15 细胞等，加入 2%扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。37培养 4872 小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。步骤如下：1. 制备抗生素浓缩液（青霉素 10000IU/mL、链霉素 10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素 5000IU/mL），小瓶分装，-20 保存。用时融化。2. 取 12g 待检病料 组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少量无菌生理盐水，将其研磨匀浆；再加入 HankSs 平衡盐溶液或细胞培养液，制
17、成20%(w/v)组织悬液；最后按 1/10 的比例加入抗生素浓缩液，混匀后室温作用1 小时；以 1000g 离心 15 分钟，取上清液备用。3. 用胰 酶消化处于对数生长期的 PK-15 细胞单层，将所得细胞悬液以1000g 离心 10 分钟，再用一定量 EMEM 生长液 含 5%胎牛血清(无 BVDV抗体) ，56灭活 30 分钟、0.3谷氨酰胺、青霉素 100I U/mL、链霉素 100I 10U/mL)悬浮，使细胞浓度为 2106/mL。4. 9 份细胞悬液与 1 份上清液混合，接种 68 支含细胞玻片的莱顿氏管(leighton s)(或其它适宜的 细胞培养瓶),每管 0.2mL；同
18、时设 3 支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照；另设 3 支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。5. 经培养 24、48、72 小时，分别取 2 管组织上清培养物及 1 管阴性对照培养物、1 管阳性对照培养物，取出细胞玻片，以磷酸缓冲盐水（PBS 液，pH7.2，0.01M）或生理盐水洗涤 2 次，每次 5 分钟，用冷丙酮(分析纯) 固定 10分钟，晾干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测（见附件 2）。6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度，判定病毒在细胞中的增殖情况，若荧光 较弱或为阴性，应按步骤 4 将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。接种细胞时操作
19、程序如下：取-20 冻 存全血样品置 37水浴融化；向 24 孔板每孔加 300微升血样以覆盖对数生长期的 PK-15 单层细 胞；37吸附 2 小时。弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入 EMEM 维持液，37培养 24 至48 小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测（见附件 2）。附件 2猪瘟荧光抗体染色法荧光抗体染色法快速、特异，可用于检测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的病毒抗原。操作程序如下：1 样品的采集和选择 1.1 活体采样：利用扁桃体采 样器（鼻捻子、开口器和采样枪）。采样器使用前均须用 3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。首先固定活猪的上唇，11用开口器打开口腔，用采
20、样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至灭菌离心管并作标记。1.2 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏和肺等 脏器，或病毒分离时待检的细胞玻片。1.3 样品采集、包装与运输按农业部相关要求执行。2 检测方法与判定2.1 方法：将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见附件 1），将液体吸干后经冷丙酮固定 510 分钟，晾干。滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中 37作用 30 分钟。然后用 PBS 液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油（pH9.09.5，0.5 M）封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。2.2 判定：在荧
21、光显微镜下，见切片或细胞培养物（细胞盖片）中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟阳性；无荧光判为阴性。2.3 荧光抑制试验：将两组猪瘟病毒感染猪的扁桃体冰冻切片，分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清（猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中 37作用 30分钟，用生理 盐水或 PBS(pH7.2)漂洗 2 次，然后进行荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不应出现荧光，或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片，隐窝上皮细胞仍出现明亮的黄绿色荧光。 附件 3兔体交互免疫试验本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒。1 试验动物家兔 1.52kg、体温波动不大的大耳白兔，并在试验前
22、1 天测基础体12温。2 试验操作方法将病猪的淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作 1：10 稀释，对 3 只健康家兔作肌肉注射，5mL/ 只，另设 3 只不注射病料的 对照兔，间隔 5 天对所有家兔静脉注射 1:20 的猪瘟兔化病毒（淋巴脾 脏毒），1mL/只，24h 后，每隔 6小时测体温一次，连续测 96 小时，对照组 2/3 出现定型热或轻型热，试验成立。3 兔体交互免疫试验结果判定接种病料后体温反应 接种猪瘟兔化弱毒后体温反应 结果判定- - 含猪瘟病毒- + 不含猪瘟病毒+ - 含猪瘟兔化病毒+ + 含非猪瘟病毒热原性物质注：“+”表示多于或等于三分之二的动物有反应。附件 4猪瘟病毒反
23、转录聚合酶链式反应（RT-PCR）RT-PCR 方法通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏感、快速的方法。在 RT-PCR 扩增的特定基因片段的基础上，进行基因序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比较分析，可进一步鉴定流行毒株的基因型，从而追踪流行毒株的传播来源或预测预报新的流行毒株。1 材料与样品准备1.1 材料准备：本试验所用试剂需用无 RNA 酶污染的容器分装；各种13离心管和带滤芯吸头需无 RNA 酶污染；剪刀、 镊子和研钵器须经干烤灭菌。1.2 样品制备：按 1：5（W/V）比例，取待 检组织和 PBS 液于研钵中充分研磨，4， 1000g 离心 15
24、分钟，取上清液转入无 RNA 酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融 3 次备用；其它样品酌情处理。制备的样品在 28保存不应超过 24 小时，长期保存应小分装后置-70以下，避免反复冻融。2 RNA 提取2.1 取 1.5mL 离心管，每管加入 800L RNA 提取液（通用 Trizol）和被检样品 200L，充分混匀，静置 5 分钟。同 时设阳性和阴性对照管，每份样品换一个吸头。2.22.2 加入 200L 氯仿，充分混匀，静置 5 分钟，4、12000g 离心15 分钟。2.3 取上清约 500L（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，加等量异丙醇，颠 倒混匀，室温
25、静置 10 分钟， 4、12000g 离心 10 分钟。2.4 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入 1000L 75%乙醇，颠倒洗涤， 4、12000g 离心 10 分钟。2.5 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4000 g 离心 10 分钟，将管壁上残余液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到有沉淀的一面，每份样品换一个吸头，室温干燥。2.6 加入 10L DEPC 水和 10U RNasin,轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，4000 g 离心 10 分钟，尽快进行试验。 长期保存应置-70以下。3 cDNA 合成取 200L PCR 专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加
26、 10L 14RNA 和 50 pM 下游引物 P2 (P25-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC -3)，按反转录试剂盒说明书进行。4 PCR4.1 取 200LPCR 专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加上述 10L cDNA 和适量水，95预变性 5 分钟。4.2 每管加入 10 倍稀 释缓冲液 5L，上游引物 P1（5-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3）和下游引物 P2 各 50pM，10 mol/L dNTP 2L，Taq 酶 2.5U，补水至 50L。4.3 置 PCR 仪，循 环条件为 95C 50sec，
27、58C 60sec，72C 35sec，共40 个循环， 72C 延伸 5 分钟。5结果判定 取 RT-PCR 产物 5L，于 1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含 0.5L /mL溴化乙锭， 电泳缓冲液为 0.5TBE，80V 30 分钟，电泳完后于长波紫外灯下观察拍照。阳性对照管和样品检测管出现 251nt 的特异条带判为阳性；阴性管和样品检测管未出现特异条带判为阴性。附件 5猪瘟抗原双抗体夹心 ELISA 检测方法本方法通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心，并采用辣根过氧化物酶标记物检测，对外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心 ELISA 方
28、法。具体如下：1 试剂盒组成1.1 多克隆羊抗血清包被板条 8 孔12 条（96 孔）1.2 CSFV 阳性对照，含有防腐剂 1.5mL151.3 CSFV 阴性对照，含有防腐剂 1.5mL1.4 100 倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100） 辣根过氧化物酶标记抗鼠 IgG，含防腐剂 200uL1.5 10 倍浓缩样品稀释液（10） 55mL1.6 底物液，TMB/H2O2 溶液 12mL1.7 终止液，1M HCL（小心， 强酸） 12mL1.8 10 倍浓缩洗涤液（10） 125mL1.9 CSFV 单克隆抗体，含防腐剂 4mL1.10 酶标抗体稀释液 15 mL2 样品制备注意：制备好的
29、样品或组织可以在 27保存 7 天，或-20冷冻保存6 个月以上。但这些样品在应用前应该再次以 1500g 离心 10 分钟或 10000g离心 25 分钟。2.1 外周血白细胞2.1.1 取 10mL 肝素或 EDTA 抗凝血样品，1500g 离心 1520 分钟。2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入 500uL 样品稀释液（1）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置 1 小时，期间不时旋涡混合。然后直接进行步骤 2.1.6 操作。2.1.3 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团（包括红细胞）。将细胞加进 10mL 的离心管，并加入 5mL 预冷（27 ，下同）的 0.
30、17M NH4Cl。混匀，静置 10 分钟。2.1.4 用冷（27 ）超 纯水或双蒸水加满离心管， 轻轻上下颠倒混匀，161500g 离心 5 分钟。2.1.5 弃去上清，向 细 胞团中加入 500uL 样品稀释液（1）,用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置 1 小时。期间不时旋涡混合。2.1.6 1500g 离心 5 分钟,取上清液按操作步骤进行检测。注意：处理好的的样品可以在 27保存 7 天，或-20冷冻保存 6 个月以上。但这些样品在使用前必须再次离心。2.2 外周血白细胞（简化方法）2.2.1 取 0.52mL 肝素或 EDTA 抗凝血与等体积冷 0.17 M NH4C
31、l 加入离心管混合。室温放置 10 分钟。2.2.2 1500g 离心 10 分钟（或 10000g 离心 23 分钟），弃上清。2.2.3 用冷（27 ）超 纯水或双蒸水加满离心管， 轻轻上下颠倒混匀，1500g 离心 5 分钟。2.2.4 弃去上清，向 细 胞团加入 500ul 样本稀释液（1）。旋涡振荡充分混匀，室温放置 1 小时。期间不时旋涡混匀。取 75ul 按照“操作步骤” 进行检测。2.3 全血（肝素或 EDTA 抗凝）2.3.1 取 25uL 10 倍浓缩样品稀释液（10）和 475uL 全血加入微量离心管，在旋涡 振荡器上混匀。2.3.2 室温下孵育 1 小时，期间不时旋涡混
32、合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。或：直接将 75uL 全血加入酶标板孔中，再加入 10uL 5 倍浓缩样品稀释液（5）。晃动酶标板板条，使 样品混合均匀。再按照 “操作步骤”进行检测。2.4 细胞培养物172.4.1 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入离心管中。2.4.2 2500g 离心 5 分钟，弃上清。2.4.3 向细胞团中加入 500uL 样品稀释液（1）。旋涡振荡充分混匀，室温孵育 1 小时。期间不时旋涡混合。取此样品 75uL 按照“操作步骤” 进行检测。2.5 组织最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于 27冷藏保存 1 个月。每只动物检测 12 种组织
33、，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。2.5.1 取 12g 组织用剪刀剪成小碎块（25mm 大小）。2.5.2 将组织碎块加入 10mL 离心管，加入 5mL 样品稀释液（1）,旋涡振荡混匀，室温下孵育 121 小时，期间不时旋涡混合。2.5.32.5.3 1500g 离心 5 分钟，取 75uL 上清液按照“操作步骤” 进行检测。3 操作步骤注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温 1822；使用前试剂应在室温条件下至少放置 1 小时。3.1 每孔加入 25uLCSFV 特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器操作。3.2 在相应孔中分别加入 75uL 阳性对照、阴性对照，各加 2 孔。
34、注意更换吸头。3.3 在其余孔中分 别 加入 75uL 制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使 样品混合均匀。183.4 置湿盒中或用胶条密封后室温（ 1822 ）孵育过夜。也可以孵育4 个小时，但是 这样会降低检测灵敏度。3.5 甩掉孔中液体，用洗 涤液（1）洗涤 5 次，每次洗涤都要将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗 涤液 250300uL 用自动洗板机洗涤 5 次。注意: ，洗涤酶标板要仔细。3.6 每孔加入 100uL 稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温孵育 1 小时。3.7 重复操作步 骤 3.5；每孔加入 100uL 底
35、物液，在暗处室温孵育 10分钟。第 1 孔加入底物液开始计时。3.8 每孔加入 100uL 终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物液的顺序一致。3.9 在酶标仪上测量样品与对照孔在 450nm 处的吸光值，或测量在450nm 和 620nm 双波长的吸光值（空气调零）。3.10 计 算每个样品和阳性 对照孔的矫正 OD 值的平均值（参见“ 计算方法” ）。4 计算方法首先计算样品和对照孔的 OD 平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的 OD 平均值必须进行矫正， 矫正的 OD 值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。矫正 OD 值样本 OD 值阴性对照 OD 值5 试验有效性判定
36、阳性对照 OD 平均值应该 大于 0.500，阴性 对照 OD 平均值应小于阳性对照平均值的 20，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行19重测。如果阴性对照的 OD 值始终很高，将阴性对照在微量离心机中 10000g离心 35 分钟，重新检测。6 结果判定被检样品的矫正 OD 值 大于或等于 0.300，则为阳性；被检样品的矫正 OD 值 小于 0.200，则为阴性；被检样品的矫正 OD 值 大于 0.200，小于 0.300，则为可疑。20附件 6猪瘟病毒抗体阻断 ELISA 检测方法本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断 ELISA 方法，通过待 测抗体和单克隆
37、抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。1 操作步骤在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温 1825。使用前应将各组分放置于室温至少 1 小时。1.1 分别将 50uL 样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。1.2 分别 将 50uL 的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。1.3 分别 将 50uL 的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。1.4 轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使将反应板中的溶液混匀。1.5 将微量反应板用封条封 闭置或于湿箱中（ 1825）孵育 2 小时，也可以将微量反应板用
38、封条置或于湿箱中孵育过夜。211.6 吸出反应孔中的液体，并用稀 释好的洗涤液洗涤 3 次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。1.7 分别 将 100uL 的抗 CSFV 酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育 30 分钟。1.8 洗板（见 1.6）后，分别将 100uL 的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置 10 分钟。加完第一孔后即可计时。1.9 在每个反 应孔中加入 100uL 终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。1.10 在 450nm 处测 定样本以及对照的吸光值，也可用双波长(450nm和 620nm)测 定样本以及对照
39、的吸光度值，空气调零。1.11 计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下：计算被检样本的平均值 OD450（ODTEST）、阳性对照的平均值（ODPOS）、阴性对照的平均值（ODNEG）。根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率； ODNEG- ODTEST阻断率100%ODNEG2 试验有效性阴性对照的平均 OD450 应大于 0.50。阳性 对照的阻断率应大于50%。3 结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于 40，该样本被判定为阳性（有CSFV 抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于 30，该样本被判定22为阴性（无 CSFV 抗体存在）。如果被检样本阻断率在 3040之间，应在
40、数日后再对该动物进行重测。附件 7荧光抗体病毒中和试验本方法是国际贸易指定的猪瘟抗体检测方法。 该试验是采用固定病毒稀释血清的方法。测定的结果表示待检血清中抗体的中和效价。具体操作如下：将浓度为 2105 细胞/mL 的 PK-15 细胞悬液接种到带有细胞玻片的5cm 平皿或莱 顿氏管（ leightons），也可接种到平底微量培养板中；细胞培养箱中 37培养至汇合率为 70%80%的细胞单层（12 天）。将待检血清 56灭活 30 分钟，用无血清 EMEM 培养液作 2 倍系列稀释；将稀释的待检血清与含 200TCID50/0.1mL 的猪瘟病毒 悬液等体积混合，置 37孵育 12 小时；用
41、无血清 EMEM 培养液漂洗细胞单层。然后，加入血清病毒混合物，每个稀释度加 2 个莱顿氏管或培养板上的 2 个孔，37孵育 1 小时； 吸出反应物，加入 EMEM 维持液含 2%胎牛血清(无 BVDV 抗体) ，56灭活 30 分钟 、0.3谷氨酰胺、青霉素 100IU/mL、链霉素 100IU/mL)，2337继续培养 4872 小时；最终用荧光抗体染色法进行检测（见附件 2）。根据特异荧光的有无来计算中和效价。(中和效价值达到多少表示抗体阳性或抗体达到保护)附件 8猪瘟中和试验方法本试验采用固定抗原稀释血清的方法，利用家兔来检测猪体的抗体。1 操作程序1.1 先测定猪瘟兔化弱毒（抗原）
42、对家兔的最小感染量。试验时，将抗原用生理盐水稀释，使每 1mL 含有 100 个兔的最小感染量，为工作抗原（如抗原对兔的最小感染量为 10-5/mL，则将抗原稀 释成 1000 倍使用）。1.2 将被检猪血清分别用生理盐水作 2 倍稀释，与含有 100 个兔的最小感染量工作抗原等量混合，摇匀后，置 1015中和 2 小时，其间振摇23 次。同 时设含有相同工作抗原量加等量生理盐水（不加血清）的对照组，与被检组在同样条件下处理。1.3 中和完毕，被检组各注射家兔 12 只，对照组注射家兔 2 只，每只耳静脉注射 1mL，观 察体温反应，并判定结果。2 结果判定 2.1 当对照组 2 只家兔均呈定
43、型热反应（+），或 1 只兔呈定型热反应（+），另一只兔呈轻热反应时，方能判定结 果。被检组如用 1 只家兔，须呈定型热反应；如用 2 只家兔，每只家兔应呈定型热反应或轻热反应，被检血清判为阴性。242.2 兔体体温反应标准如下：2.2.1 热 反应（+ ）:潜伏期 2472 小时，体温上升呈明显曲线，超过常温 1以上，稽留 1236 小时。2.2.2 可疑反应（）:潜伏期不到 24 小时或 72 小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到 12 小时或超过 36 小时而不下降。2.2.3 无反应（）:体温正常。附件 9消 毒 1 药品种类消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的，如烧碱、醛类、氧化剂类、氯
44、制剂类、双季胺 盐类等。2 消毒范围猪舍地面及内外墙壁，舍外环境，饲养、 饮水等用具，运输等设施设备以及其它一切可能被污染的场所和设施设备。3 消毒前的准备3.1 消毒前必须清除有机物、污物、粪便、 饲料、垫料等；3.2 消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的；3.3 备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护用具（如口罩、手套、防护靴等）、消毒容器等。4 消毒方法4.1 金属设施设备的消毒，可采取火焰、熏蒸等方式消毒；4.2 猪舍、场地、 车辆等，可采用消毒液清洗、喷洒等方式消毒；254.3 养猪场的饲料、垫料等，可采取堆积发酵或焚烧等方式处理；4.4 粪便等可采取堆积密封发酵或焚烧等方式处理；4.5 饲养、管理等人员可采取淋浴消毒；4.6 衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒；4.7 疫区范围内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒的方式消毒；4.8 屠宰加工、 贮藏等 场所以及区域内池塘等水域的消毒可采取相应的方式进行，避免造成污染。
