1、1 材 料 与 方 法1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8荧光抗体)。1. 2 动物与分组Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 8 周龄，体重18 22g。颗粒饲料，室温(22 2) ，湿度60%
2、80% 。动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二:测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和CTX-2 组。1. 3 实验方法和测定指标1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔注射给予动物200 mg / kg
3、环磷酰胺2，3( 用蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周后测定各项免疫指标。1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数4 动物处死前眼眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行测定，每管加入50l 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r /min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min离心5mi
4、n，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验5，61. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hanks 液洗2 次，每次离心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hanks 液，混匀后1000r /min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培养液重悬，调整细胞浓度为2 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照
5、孔。1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50g / (2 5) 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37 水浴30min。用Hanks 液洗P815 细胞3 次，之后Hanks 液悬浮P815 细胞，室温孵育15 20min 后，离心1 次。将P815 悬浮于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 106 个/ml，加0. 5ml 此悬液于含有脾细胞悬液的24 孔( 包括对照孔)板中。37、5% CO2孵育5 天。5
6、 天期间，每隔一天换一次液。1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用Hanks 液洗1 次，200r /min 离心10min，收集细胞，重悬于RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 107 /ml。用完全培养液配制3 个系列稀释的细胞悬液，每个稀释度100l，做3 个复孔。1. 3. 3. 4 制备靶细胞离心处于对数生长期的P815 细胞，重悬于0. 5ml Hanks 液里，离心后重悬于RPMI1640 完全培养液，调整细胞浓度为2 105 个/ml。1. 3. 3. 5 CTL 检测按效应细胞和靶细胞比为100 1、50 1、25 1和12.
7、 5 1( 各加100l) 在圆孔96 孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200l，设3 个复孔。同时设靶细胞自然释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液) 和最大释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40 液) ，效应细胞对照孔(0. 1ml 效应细胞+ 0. 1ml 培养液) ，用96 孔板水平转头500r /min 离心5min，37、5% CO2培养4 6h。1000r /min离心5min，每孔吸取100l 上清，加于另一ELISA 反应板的孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50l，室温避光反应30min 后，每孔加入50l 终止液，终止
8、酶促反应。在酶联检测仪492nm 波长下读取各孔A 值，CTL 活性用杀伤率表示，按如下公式计算:CTL 杀伤率(% ) = ( 实验孔A 值 靶细胞对照孔A 值 效应细胞对照孔A 值) / ( 靶细胞最大释放孔A值 靶细胞对照孔A 值) 100% 。1. 3. 4 NK 细胞活性测定1. 3. 4. 1 靶细胞传代实验前24h 将靶细胞进行传代培养，应用前以Hanks 液洗2 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4 105 个_/ml。1. 3. 4. 2 效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度。效应细胞的数量为5 106 个/ml，效
9、应细胞和靶细胞之比为50 1。1. 3. 4. 3 NK 细胞活性测定反应孔加靶细胞和效应细胞各100l 于96 孔U 形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和培养液各100l，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% 的NP40或2. 5% Triton 各100l，每样做3 个平行样。37、5% CO2条件下培养4h。培养结束后，96 孔培养板1500r /min 离心5min，每孔吸取上清100l 置于平底96 孔板中，同时加入LDH 基质液100l，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L 的HCl 30l，在酶标仪490nm 处测定A 值。用下列公式计算:NK 细胞活性(% ) = ( 反应
10、孔A 值 靶细胞自然释放孔A值) / ( 最大释放孔A 值 靶细胞自然释放孔A 值) 100% 。1. 3. 5 半数溶血值的测定(HC50)1. 3. 5. 1 制备补体采集豚鼠血，分离出血清( 至少5 只豚鼠的混合血清) ，将1ml 压积SRBC 加入到5ml 豚鼠血清中，放4 冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装， 70 保存。用时以SA 液按1 8稀释。第3 期齐丽娟，等. 用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型3151. 3. 5. 2 免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞( SRBC) ，并用生理盐水配成2% ( V /V) 的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0. 2ml 进行免疫。4
11、5 天后，由动物眼眶内眦静脉取血，2000r /min 离心10min 收集血清。1. 3. 5. 3 溶血反应取血清用SA 缓冲液稀释( 一般为200 500 倍)。将稀释后的血清1ml 置试管内，依次加入10% SRBC 0. 5ml，补体1ml( 用SA 液按1 8稀释)。另设不加血清的对照管( 以SA 缓冲液代替)。置37 恒温水浴中保温15 30min 后，冰浴终止反应。2000r /min 离心10min。取上清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml 加都氏试剂至4ml，充分混匀，放置10min 后，于540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
12、按下列公式计算HC50。HC50 =样品光密度值SRBC 半数溶血时的光密度值 稀释倍数1. 4 统计分析采用SPSS 13. 0 统计软件进行方差分析或非参数检验。2 结果2. 1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响由表1 可见，CTX-1 组和CTX-2 组小鼠体重较对照组显著降低(P 0. 001)。CTX-1 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组增高(P 0. 001) ，CTX-2 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组降低(P 0. 001，P 0. 05)。表1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响Table 1 The wei
13、ght and absolute and relativespleen weight in each group( n = 8，珔x s)组别体重( g)脾脏绝对重量( g) 相对重量(% )对照组22. 36 1. 06 0. 071 0. 007 0. 319 0. 031CTX-1 组16. 31 2. 05 (3) 0. 081 0. 018 (1) 0. 505 0. 142 (2)CTX-2 组19. 18 0. 48 (3) 0. 047 0. 009 (2) 0. 243 0. 042 (1)注:与对照组比较(1) P 0. 05，(2) P 0. 0012. 2 CTX 不同
14、给药方法对Balb /C 小鼠淋巴细胞分类计数的影响由表2 可见，CTX-1 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B淋巴细胞( CD 3 CD +19) (% )、T 淋巴细胞( CD +3 CD 19) (% )、Th细胞(CD +3 CD +4 CD 8) (% ) 和Ts 细胞( CD +3 CD 4 CD +8) (% ) 及Th /Ts 比值均较对照组显著降低(P 0. 05) ;CTX-2 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B 淋巴细胞(% ) 较对照组降低( P 0. 001) ; CTX-2 组小鼠外周血T 淋巴细胞(% )、Th 细胞(% )、Ts 细胞(% ) 及Th
15、 /Ts 比值较对照组增高( P 0. 001，P 0. 001，P 0. 05，P 0. 05，P 0. 001)。表2 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠外周血淋巴细胞分类计数的影响Table 2 Phenotypic analysis results of peripherial blood T lymphocytes in each group( n = 8，珔x s)组别CD 3 CD +19(% ) CD +3 CD 19(% ) CD +3 CD +4 CD 8(% ) CD +3 CD 4 CD +8(% ) Th /Ts(% ) LYM LYM(% )对照组15. 7
16、6 7. 29 49. 88 8. 58 29. 90 13. 33 11. 08 5. 18 2. 29 0. 70 16. 60 6. 20 67. 13 7. 79CTX-1 组0. 20 0. 17 (3) 4. 03 2. 00 (3) 1. 12 1. 37 (3) 1. 34 0. 84 (3) 0. 72 0. 41 (3) 2. 89 1. 95 (3) 56. 11 15. 96 (2)CTX-2 组3. 31 1. 74 (3) 88. 37 2. 95 (3) 65. 53 23. 69 (1) 15. 96 1. 38 (1) 4. 14 1. 60 (3) 1. 9
17、7 2. 28 (3) 11. 72 3. 51 (3)注:与对照组比较(1) P 0. 05，(2) P 0. 01，(3) P 0. 0012. 3 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠HC50、CTL 细胞活性和NK 细胞活性的影响由表3 可见，CTX-1 组和CTX-2 组NK 细胞活性(% ) 较对照组显著降低(P 0. 05)。CTX-1 组和CTX-2 组CTL 细胞活性(% ) 均较对照组显著降低(P 0. 05)。CTX-1 组和CTX-2 组小鼠HC50均较对照组显著降低(P 0. 05)。表3 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠HC50、CTL 细胞和NK
18、细胞活性的影响Table 3 The HC50，CTL cell and NK cell activity changes ineach group( n = 8，珔x s)组别HC50CTL 细胞活性(% )NK 细胞活性(% )对照组49. 24 29. 93 7. 17 4. 26 12. 16 8. 30CTX-1 组6. 89 2. 23 (1) 2. 24 1. 35 (1) 5. 96 2. 80 (1)CTX-2 组4. 05 2. 19 (1) 2. 42 2. 67 (1) 4. 67 3. 57 (1)注: (1) 与对照组比较P 0. 053 讨论环磷酰胺作为一种免疫抑
19、制剂，已有大量研究表明其能抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制7-9。本实验研究结果表明:正常小鼠连续30 天灌胃CTX 60mg / kg(CTX-1 组) 和腹腔注射200mg / kg CTX( CTX-2 组) 1 天均引起小鼠较为严重的免疫抑制。外周血淋巴细胞数目和百分比下降(P 0. 01)、体重下降( P 0. 001)、CTL 细胞活性和NK细胞活性下降(P 0. 05)、HC50下降(P 0. 05)。有研究发现环磷酰胺可引起脾脏萎缩10，11，本实验研究发现CTX-1 组小鼠脾脏绝对重量和相对重量增加，这可能是低剂量环磷酰胺引起小鼠脾脏代偿性增生引起的，尚待进一
20、步验证。淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调节功能所必需的，是评估机体细胞免疫功能的重要指标。本研究表明两组CTX 均使LYM 和LYM 百分比、B 淋巴细胞百分比下降，但是与CTX-1 组不同之处在于，CTX-2 组T 淋巴细胞(% ) 升高。这可能提示高剂量环磷酰胺在短时间作用下对非T 淋巴细胞有更明显的细胞毒作用，造成T 淋巴细胞比例的相对增加。而CTX-2 组Th 细胞(% )、Ts 细胞(% ) 及Th /Ts 比值也升高，这可能提示环磷酰胺对不同亚类T 细胞的敏感性不同，对Ts 细胞较敏感，而对Th 细胞敏感性稍差，从而导致Th /Ts比值的相对升高3，12。因此两组CTX 在一定程度上均干扰了小鼠淋巴细胞亚群的稳定。本研究提示连续30 天灌胃给予60mg / kg 环磷酰胺与一次性腹腔注射200mg / kg 环磷酰胺均可建立环磷酰胺免疫低下模型，但有文献报道环磷酰胺一次性大剂量给药造成的免疫抑制维持时间一般不超过2 周13，不能满足保健食品起效周期长的特点。且由于评价保健食品安全性所采用的给药方式一般为经口给予，因此，经口给予环磷酰胺更能模拟受试物体内代谢情况。所以，本研究中连续30 天小剂量环磷酰胺给药方式较适用于保健食品安全性评价中免疫低下模型的建立。
