1、高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography,第一节、概述,一、含义液相色谱 (LC) ：以溶剂液体为流动相的色谱方法高效液相色谱（HPLC）：高效能固体细微粒为固定相高压溶剂为流动相高灵敏度检测器,二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较,1. HPLC与经典LC的比较,2. HPLC与GC的比较,相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测,按固定相的聚集状态分类： 液-固色谱法 液-液色谱法 按分离机制分类： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法,三、HPLC分类,其它分离机制色谱法： 亲合色谱法
2、 AC 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC 毛细管电色谱法 CEC,三、HPLC分类,当前最常见的HPLC： 化学键合相色谱法（bonded phase chromotography),化学、生物学和医学等应用广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多(80%)是通过HPLC来完成的。,四、 应用,各种HPLC方法的应用范围及对象,第二节 HPLC仪器,第二节 HPLC仪器,高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置 进样系统：进样器，进样阀 分离系统：色谱柱，恒温箱 检测系统：检测器 记录系统：记录装置
3、、色谱工作站,1、贮液器和吸滤器：,一、 高压输液系统,贮液器: 1-2L的玻璃瓶,溶剂吸滤器: Ni合金，孔约0.45 m，防止颗粒物进行泵内。,2、高压输液泵,一、 高压输液系统,要求,流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min 耐高压：输出压力常达30-60MPa 液流稳定。 结构材料应耐化学腐蚀,活塞型往复泵 液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵,双活塞型往复泵,一、 高压输液系统,离线超声波振荡脱气 在线惰性气体鼓泡吹扫脱气 在线真空脱气装置,3、脱气装置 ：,将相对分子量小的气体从溶剂中除去,一、 高压输液系统,4、梯度洗脱装置：,
4、为什么要进行梯度洗脱？,使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离,梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。,一、 高压输液系统,高压梯度： 用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器,一、 高压输液系统,低压梯度： 只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。,二、 进样系统,将样品溶液准确送入色谱柱的装置手动方式、自动方式,密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。,进样器要求,常用手动进样器六通阀进样器，,二、 进样系统,六通阀进样,Load,Inject,三、 色
5、谱柱,柱长1530cm，内径45mm,基质 (硅胶或高分子聚合物微球),功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团),四、 检测系统,用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。,溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应 紫外、荧光、电化学检测器,总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应 示差折光，电导检测器,四、 检测系统,1、紫外检测器,微量吸收池，光程为2-10mm, 体积约为110 L,最小检测量10-9gml-1 对流量和温度波动不敏感 可用于梯度洗脱。,最常用的通用型检测器,四、 检测系统,光电二极管阵列检测器,时间、光强度和波长三维谱,2、荧光
6、检测器,四、 检测系统,灵敏度高 选择性好 样品量很小 适合药物和生化样品分析,3、蒸发光散射检测器,四、 检测系统,适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,通用型和质量型检测器,溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度 通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗,4、示差折光检测器,四、 检测系统,5、安培检测器,利用待测物在工作电极表面发生反应产生电流，此电流大小与待测物浓度成正比。,流动相必须含电解质，且呈化学隋性。 只能检测具有电活性的物质。,四、 检测系统,五 、 数据处理和计算机控制系统,色谱工作站
7、 在线显示 自动采集 处理储存 自动控制,1、要求：粒径小、颗粒分布均匀传质快、渗透压小机械强度高、能耐高压化学稳定性好,第三节、HPLC的固定相和流动相,一、固定相,一、固定相,（1） 按承受压力分 刚性固体：硅胶为基质主要用于吸附、分配和键合色谱 硬 胶：以聚合物为基质主要用于离子交换和尺寸排阻色谱,2、固定相载体,（2）按孔隙深度分 表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料适于常规分离分析 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成 适于复杂混合物的分离。,一、固定相,2、固定相载体,3. 常用固定相 液固色谱固定相常用粒径310m，理论塔板数过 5 万/米无定形全多孔硅
8、胶：YWG球形全多孔硅胶：YQG高分子多孔微球：YSG,一、固定相,3. 常用固定相 化学键合固定相以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上,一、固定相,Si-O-R： 热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相 Si-R(或Si-N)： 不水解，热稳定性较好。但格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R： 不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定,3. 常用固定相 化学键合固定相,一、固定相,3. 常用固定相 化学键合固定相 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18） 中等极性键合相：醚基键合相 极性键合相：氨基、氰基键合相,一
9、、固定相,3. 常用固定相 其它固定相 离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂 空间排阻色谱固定相：凝胶 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体,一、固定相,二、流动相淋洗液，洗脱剂,对样品有适宜溶解度， k = 2 5； 溶剂要与检测器匹配。 高纯度、化学稳定性好 适宜的粘度。过高柱压增加；过低易生气泡,1、流动相要求,常用的低粘度溶剂：甲醇、乙晴等 粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等,2、流动相组成,按组成不同：单组分和多组分； 按极性：极性、弱极性、非极性； 按使用方式：固定组成淋洗和梯度淋洗。,二元或多元组合溶剂可灵活调节
10、流动相极性,常用溶剂: 烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。,二、流动相淋洗液，洗脱剂,正相色谱：极性固定相非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）极性柱（正相柱）,三、固定相和流动相的选择,反相色谱：非极性键合固定相（ODS）极性流动相非极性柱（反相柱）,组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性）,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,HPLC方法,按流动相和固定相特征分为正相色谱、反相色谱 按分离目的分为分析型、制备型 按分离机理分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。,第三节 HPLC方法及原理,一、液-液分配色谱法
11、（LLPC） 二、化学键合相色谱法（CBPC） 三、液-固吸附色谱法(LSAC) 四、离子交换色谱法（IEC） 五、离子对色谱法（IPC） 六、尺寸排阻色谱法（SEC） 七、亲和色谱法（AC）,一、液-液分配色谱法（LLPC）,1.固定相,强极性固定液：，一氧二丙睛 中等极性固定液：聚乙二醇 非极性固定液：角鲨烷,要求：流动相不与固定相互溶，流动相与固定相极性差别显著避免固定液流失,2.流动相,一、液-液分配色谱法（LLPC）,适于各种极性化合物的分离,4. 用途,根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。,3.分离原理,缺点：固定液机械涂渍、固定液易流失,1、反相键合相
12、色谱法（RPBPC）,固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等,二、化学键合相色谱法（CBPC）,流动相：采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。,分离机理疏溶剂作用理论,非极性的烷基键合相 硅胶表面的十八烷基“分子毛” 较强的疏水特性。,二、化学键合相色谱法（CBPC）,1、反相键合相色谱法（RPBPC）,分子中非极性部分疏水烷基缔合作用，分子保留 分子极性部分极性流动相离开固定相，减小保留,两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为,流动相极性溶剂 分离物极性官能团有机物,改变流动相配比可分离极性化合物 用水和无机盐的缓冲
13、液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。,用途,1、反相键合相色谱法（RPBPC）,主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物,二、化学键合相色谱法（CBPC）,固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面 流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等） 分离机理：范德华力、诱导力或氢键力 用途：多用于分离极性或中等极性化合物,2、正相键合相色谱法（NPBPC）,二、化学键合相色谱法（CBPC）,3、离子键合相色谱法,固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、C00H 流动相：一般采用缓冲溶液。,二、化学键合相色
14、谱法（CBPC）,分离原理：与离子交换色谱类同,用途：多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等,分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同,三、液-固吸附色谱法(LSAC),固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂硅胶、氧化铝、聚酸胶等。,流动相：各种极性的洗脱剂,用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体,原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别,固定相： 基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂,四、离子交换色谱法（IEC）,流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液,用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸
15、、蛋白质等生物大分子。,离子对AB具有疏水性，被非极性固定相提取不同待测离子A1，A2与B离子间成对能力不同，形成不同疏水性离子对，从而保留值不同,原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB，间接改变待测离子保留特性,五、离子对色谱法（IPC）,如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液,用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱,固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。,流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。,六、尺寸排阻色谱法（SEC）,常用流动相 四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水,原理：利用被测组分分子大小
16、不同、在固定相上选择性渗透实现分离。,凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离,用途,六、尺寸排阻色谱法（SEC）,特点： 固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长 相对分子质量差别必须大于10才能分离,七、亲和色谱法（AC）,原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离,固定相：生物专一性配基+载体 流动相：一定pH的缓冲液,具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；没有亲和力作用的分子不被保留。,用途：蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析,第四节 HPLC分离条件的选择,根据
17、van Deemter方程和色谱分离方程式选择分析条件,在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u,（1）固定相： 粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力； 改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。,第四节 HPLC分离条件的选择,（2）流动相： 低粘度的流动相增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm减少传质阻力 （3）流速： 最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速加快分析速度,第四节 HPLC分离条件的选择,（4）柱温： 提高柱温降低流动相粘度减少
18、传质阻力分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡， 一般在室温下进行,第四节 HPLC分离条件的选择,第五节 HPLC的建立与应用,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。,材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,3.分析条件的优化,流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量,一、建立HPLC分
19、析方法的一般步骤,4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。,二、HPLC定性定量分析方法,1、定性分析,色谱鉴定法：保留时间对照 化学鉴定法：利用专属化学反应对分离后收集的组分定性 色谱-光谱联用定性非在线色谱光谱联用法：色谱光谱联用仪,二、HPLC定性定量分析方法,2、定量分析,外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等不需知道校正因子，但需进样量准确 内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法,1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等； 食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等； 食品污染物分析：霉菌毒素
20、、微量元素、多环芳烃等。 2、在环境分析中的应用多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。,三、HPLC的应用,3、在生命科学中的应用分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具 低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定 高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定,三、HPLC的应用,4、在医学检验中的应用体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测： 合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等 天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等 5、在无机分析中的应用阳、阴离子的分析等。,三、HPLC的应用,我国药典收载HPLC法项
21、目和数量比较表,2010版药典二部中色谱柱的使用情况,第六节 毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis,一、含义,电泳：在电场作用下，电解质溶液中的带电质点向电荷相反的电极方向迁移的过程。 毛细管电泳：在毛细管中进行的电泳。,电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动,正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 中性分子所受的力：电渗力,二、基本原理,电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。流出顺序：正离子中性粒子负离子,毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）胶束电动毛细
22、管色谱（MECC） 毛细管离子分析,三、分类,1、毛细管区带电泳 CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出 中性粒子：无电泳，受电渗流影响，在阳离子后流出,最基本、应用广的分离模式,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,2、毛细管凝胶电泳 CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,（1）缓冲溶
23、液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,（2）电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,（5）色谱与电泳分离模式的结合。,（3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；（4）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,加电渗流改性剂使电渗流反向，用于淌度很大的离子的分离，主要是无机阴离子的分离。负高压 。加阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵,4、 毛细管离子分析,三、 高效毛
24、细管电泳仪器,1、高压电源：产生030kV 稳定连续可调电压,2、进样系统,进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小； 进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样,4、检测系统 商品仪器：UV-VIS；荧光 实验室：质谱，电分析 5、清洗系统 一般用负压法，NaOH洗液，减少吸附,3、毛细管柱：毛细管分离柱不涂敷任何固定液,四、 应用及前景 特点： A、分离效率高：104理论塔板数，接近GC 空心管，无固定液，H = B/u；流型不同 B、 分离速度快：优于LC，接近GC C、进样量少：nL,应用： 药物分析：旋光异构体 生化分析：氨基酸衍生物、蛋白、DNA 弱点： 检测器绝对灵敏度高，但浓度灵敏度仅为10-6,2010版药典二部采用电泳法的品种,2010版药典二部采用CE的品种,例：毛细管电泳（抑肽酶）,sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图,18.417分钟的是去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶， 18.617分钟的是去丙氨酸-抑肽酶， 18.829分钟的是抑肽酶峰,
