1、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳,小组成员：杨松，祁平新，谭华发，礼 庄曾,实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。,实验原理,DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。 在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验器材和试剂,实验器材： 制胶模具，水平式电泳槽，电泳
2、仪，微量移液器, 微波炉, 紫外透射仪或凝胶成像系统。 样品： DNA分子量标准品，质粒 试剂 琼脂糖 1电泳缓冲液（TBE） 6上样缓冲液 溴化乙锭(EB) ：10mg/ml,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。,琼脂糖凝胶,天然琼脂（ag
3、ar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（agarose） 琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。,琼脂,琼脂糖凝胶的优点,(1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,缺点： 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前
4、配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,影响琼脂糖凝胶电泳的因素,DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。,上样缓冲液,0.25溴酚兰；0.25二甲苯青；30甘油水溶液 作用： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便,电泳指示剂：核酸电泳常用
5、的指示剂有两种溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）；二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。,核酸电泳的染色剂,最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色,溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。,注意：EB被认为是一种强致癌物质，
6、操作时应尽量小心，配置和使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。,银染色 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收,实验操作,操作步骤,1. 准备 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子,2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶,具体步骤： 三角瓶内：1g琼脂糖 +100ml(1TBE) 煮胶溶解 冷却至60(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳
7、槽 向电泳槽中加入1xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面。,3. 加样,将DNA样品（5ul）与6 上样缓冲液（1ul） 混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。 每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。,4. 电泳,接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳,5. 结果观察,电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。,注意事项,1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制板变形； 2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔； 3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶； 4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔； 5 、紫外线照射不要太久。,THE EDD,谢谢,
