1、毕赤酵母表达的培养基配制52.1 LB（LuriaBertani）培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl lPH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养 pPICZA原核宿主菌 TOP10F时可加入 Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.5PH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZA 原核宿主菌 TOP10F时，加入 Zeocin 25ug / ml，可
2、以 4条件下保存 12 周。2.3 YPD （又称 YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium， （Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml 液体 YPD 培养基可常温保存；琼脂 YPD 平板在 4可保存几个月。加入 Zeocin 100ug / ml，成为 YPDZ 培养基，可以 4条件下保存 12 周。2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extr
3、act Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 g/ml不管是液体 YPDS 培养基，还是 YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放 4条件下，有效期12 周。2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素） 。将 800ml 灭菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml的 500*B 母液和 100ml 的 10*GY 母液
4、混匀即可，4保存，保存期为 2 个月。2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在 1000ml 的 MGY 培养基中加入 10ml 的 100*H 母液混匀，4保存，保存期为 2 个月。2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L 的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 将 186g 的山梨醇定容至 700ml，高压灭菌；2. 冷却后于 45水浴；3. 将 100ml 的 10*D、100ml
5、 的 10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液和 88ml无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 2 的山梨醇溶液混合。4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在 RD 培养基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H 母液，同时无菌水的体积减少至78ml 即可，其余配制方法与 RD 相同。4保存。2.9 RD 及 RDH 平板的制备1. 将 186g 的山梨醇和 15-20g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴；2. 参照 RD/R
6、DH 液体培养基配制的步骤 4，将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml 的500*B；10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板。4可保存数月。2.10 RD 及 RDH 的 TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将 186g 的山梨醇和 7.510g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴；2.参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4，将 100ml 的 10*D、 100ml 的 10*YNB；2ml 的5
7、00*B；10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该 TOP 琼脂置于 45水浴冷却、保温，备用。2.11 MD 与 MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5% 生物素；2% 葡萄糖）1. 100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至 1000ml即可；2. 如配制 MDH，可在上述
8、的 MD 中加入 10ml 的 100*H 即可；3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入 1520g 的琼脂。4可保存数月。2.12 SOC 培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.05Glucose (1mol / L) 2%121高压灭菌 20min，冷却后，4保存 2.13 MM 培养基：M9 母液：64g 磷酸氢二钠，15g 磷酸二氢钾，2.5g 氯化钠，5.0g 氯化铵加 1L 水灭菌取 M9 母液 200ml 加水 700ml,加 2ml1mol/l 已灭菌的硫酸镁，加 100 微升已灭菌的 1mol/l氯化钙（可加可不加） 。注意硫酸镁和 M9
9、 母液要分开灭菌不然会有沉淀。在 M9 培养基基础上添加 0.5%葡萄糖即为 MM 培养基。2.14 BMGY /BMMY 培养基：酵母粉：1.0 克，蛋白胨：2.0 克，YNB：1.34 克，0.1mol/L pH6.0(或者 pH7.0)磷酸缓冲液，甘油：1.0 毫升，加蒸馏水到 100mL 2.15 BMM 培养基，全称：Buffered minimal methanol 即最小缓冲甲醇培养基，常用于表达分泌型蛋白的培养基。配制：100mM pH6.0 磷酸钾 1.34%YNB 410-5%生物素 0.5%甲醇1. 灭菌 700ml 水，2. 冷至室温，加入下列：100ml 1M pH6
10、.0 磷酸钾缓冲液, 100ml 10YNB, 2ml 500B, 100ml 10M3. 放置于 4 度，可放 2 个月 10YNB （13.4%酵母氮源碱（ YNB）含硫酸铵不含氨基酸）溶解 134gYNB 于 1000ml 水中，过滤除菌，加热至 YNB 完全溶解，存于 4 度。或者用34gYNB（不含硫酸铵不含氨基酸） ，100g 硫酸铵进行配制，可放 1 年。注意毕赤酵母在高浓度 YNB 下生长更好。YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY ：诱导表达用；MD ：电转化后筛选 his用。YEPD 是不能代替 BMGY 的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步
11、的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用 YPG 培养基代替，只是把 YEPD 中的葡萄糖用 3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。BMGY、 BMMY 灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制 BMMY 时也没必要用 5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加 100%甲醇至你要的浓度。YNB 可以高压灭菌，没问题的，也可以 0.22um 过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配 YPD 时可以加入 YPD 一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般 121-125 度 12-15 分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致 YPD 焦化。
12、glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或 YNB 的培养基 108 度 35min 高压灭菌。小量发酵其实可以把培养基成分中的 YNB 和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含 YNB 的差） 。如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。用无机盐进行大规模发酵，更省钱。大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600 元左右，一瓶纯氧 20 元。一个批次 10
13、0h 左右估计 34 瓶氧气。关于 Tryptone 和 Peptone 的选择：1）用培养 E.coli 的 Tryptone 替代 Peptone 对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的 AH109,Y187 之类表达酵母，根本就长不好2）Tryptone 和 Peptone 虽然都是营养胨，但营养成分不一样即使是一般的表达酵母可以在 Tryptone 生长，生长状态也没有在 Peptone 中好但 tryptone 和 peptone 就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用 peptone 的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的 YNB
14、。3）如果要求不高，一般使用也还凑合尽可能的用 Peptone，difco 公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌4）用含 Peptone 的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用 Tryptone 后，培养基颜色变得很浅，和 LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen 说明书说 peptone 的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone 的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为 peptone 是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培养毕赤酵母,书上说 BIOTIN 储液是水溶液,但事
15、实上 BIOTIN 很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制 500BIOTIN stock solution（0.02）有这么 3 种方案：1） 、懒人是将 Biotin 直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2） 、急性子是将溶液配成 0.02N 的 NaOH，就很容易溶解了；3） 、水浴加热，温度不能高于 50 度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是 vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为 YNB 中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM 属于基础培养基，没有哪种成分会含有微
16、量生长因子（如生物素） 。所以肯定要加的。附：无机培养基配方BSM 无机培养基：85% H3PO4 26.7ml/LCaSO4 ?2H2O 0.93g/LK2SO4 18.2g/LMgSO4?2H2O 14.9g/LKOH 4.13g/L甘油 40g/LPMT1 4.0ml/L100%氨水调 pH5.0(1 瓶 50ml 加 800ul 氨水) 或 10g/L 硫酸铵调 pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便） 。诱导表达前调 pH6.0。pH5.0 是为了防止 BSM 形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达 HSA 融合蛋白的最适 pH。BSM 高压灭菌后再加 4.0ml/L 过滤除菌的 PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的 500ml 甲醇加 6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。PMT1（1L ）配方：CuSO4?5H2O 6.0g/L KI 0.088g/LMnSO4?H2O 3.0g/LNa2MoO4?2H2O 0.2g/LH3BO3 0.02g/LCoCl2?6H2O 0.5g/LZnCl2 20.0g/LFeSO4?7H2O 65.0g/LBiotin 0.2g/L浓 H2SO4 5.0ml
