1、药品微生物检验特点 及过程控制,中国药品生物制品检定所 马仕洪 2010年5月26日 上海,web site: e-mail: tel:010-67095509,地址：北京市天坛西里2号 邮编：100050,中国药品生物制品检定所,2,药品微生物检验特点及过程控制,药品因素 环境影响 培养观察 抽样检查 破坏试验,方法验证,过程控制,中国药品生物制品检定所,3,无菌/微生物限度检查理念,中国药品生物制品检定所,4,微生物检查的过程控制,一、实验设施（硬件物质保障） 二、检验程序（软件有效的结果） 三、结果判断（调查可靠的结论）,中国药品生物制品检定所,5,一、实验设施,实验室系统 操作环境 关
2、键设备 对照培养基,物 质 保 障,中国药品生物制品检定所,6,（一）、实验室系统,洁净实验条件 有效性：整体10000级、局部100级。 安全性：保护样品、人员和环境。 可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净实验条件的维护、验证阳性菌实验室达到P2生物安全标准,中国药品生物制品检定所,7,实验室改造示例：原布局图 拟定布局图 建议布局图1 建议布局图2 实验室系统中检所微生物实验室,中国药品生物制品检定所,8,（一）、实验室系统,实验室系统的管理与维护： 1、屏障系统的有效性压差、风速、微粒、照度（外包服务合同） 2、清洁、静态与动态监控、熏蒸 3、环境菌库酒精棉球分离微生物新洁尔灭分离微生物,中
3、国药品生物制品检定所,9,环境菌库,洁净环境常见菌（浮游菌）： 头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）,中国药品生物制品检定所,10,（二）、操作环境,1、隔离器 2、生物安全柜 3、超净工作台,中国药品生物制品检定所,11,（二）、操作环境,中国药品生物制品检定所,12,搽拭,菌液稀释、分液的误差为：5.5% 表面搽拭操作的回收率大于
4、99%,中国药品生物制品检定所,13,（三）、关键设备,微生物检查薄膜过滤仪一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器,中国药品生物制品检定所,14,（四）、对照培养基,培养基适用性（灵敏度）；培养基性能稳定性（标准化）。,对照培养基,理化评价（可控性）,生物学评价（有效性）,回收率比较,MPN比较,生长曲线比较,生态评价,某些CRS原则,固态培养基,液态培养基,琼脂加减法,中国药品生物制品检定所,15,二、检验程序,中国药品生物制品检定所,16,二、检验程序,接受任务 实验方案 实验准备 样品核对 实验操作 过程监控 培养观察,有效的结果,物 质 保 障,中国药品生物制品检定所,17
5、,实验室管理规范（软件）,中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系 编写说明及批准页 1 实验室概况 1.1 实验室简介 1.2 实验室通讯资料 1.3 实验室认可项目/参数表 1.4 实验室平面图及功能区域 1.5 仪器设备总览 1.6 常备试剂耗材一览表 1.7 实验室发展目标 2 管理规范 2.1 安全管理 2.2 业务流程 2.3 人员管理（6个SOP） 2.4 样品管理（3个SOP） 3 标准操作规程 3.1 检验工作SOP（13个） 3.2 仪器操作SOP（30个） 3.3 实验记录SOP（9个） 4 实验室保障 4.1 实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则 4.2 实验室设施服务
6、商 4.3 实验设备供应商 4.4 实验室消耗品供应商,中国药品生物制品检定所,18,（一）、实验准备,实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战” 。 尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲洗液、滤器、小型实验器材等。,中国药品生物制品检定所,19,实验准备无菌室专用酒精棉球制备 实验准备场地清洁 实验准备台面清洁,中国药品生物制品检定所,20,（二）、样品核对,尽快取得样品，确保样品传递过程中的完整性、安全性、有效性； 仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获取非问题样品及同类样品，进行比较实验、比较分析； 样品外观检查、完整性检查。,
7、中国药品生物制品检定所,21,样品外观检查欣弗 样品外观检查刺五加 样品外观检查双黄连 样品完整性真空检漏,中国药品生物制品检定所,22,（三）、实验操作,不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实验室污染。,药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节,药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节,中国药品生物制品检定所,23,实验操作物料进场,消毒液搽拭物品外表面,洁净传递（风淋、紫外照射）,双层无菌包装,核心区,外围,实验操作人员进场,一更,二更,核心操作区,实验操作无菌操作技术,中国药品生物制品检定所,24,（四）、实验过程监控,样品监控,手指监控,沉降菌监控,无菌检验框架示意图,
8、中国药品生物制品检定所,25,三、结果判断,长菌与否 分离鉴定 溯源调查 结果报告,可靠的结论,有效的结果,物 质 保 障,中国药品生物制品检定所,26,三、结果判断,是不是微生物？是什么微生物？微生物来自哪里？几点思考参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂志，2008， 28（05）：6671,中国药品生物制品检定所,27,1、长菌与否？,浑不浑浊? 物理变化、化学变化还是生物变化？,一靠经验 二靠实验 三靠严格程序控制避免干扰,中国药品生物制品检定所,28,是
9、不是微生物？,（1）、液体培养基浑浊物理变化？化学变化？生物学变化？ （2）、平板上的菌落琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层菌落or药渣？,中国药品生物制品检定所,29,菌落or药渣？,经60Co射线大剂量照射再检验 延长培养时间到7天 重新划线培养 镜检,中国药品生物制品检定所,30,2、分离鉴定,（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养； （2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存； （3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物； （4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴
10、定，并逐一保藏。,中国药品生物制品检定所,31,是什么微生物？,宏观：生长形态 微观：镜检 鉴定：生化鉴定（API、BD）核酸鉴定（16sRNA、DNA）,中国药品生物制品检定所,32,3、溯源调查,样品阳性培养物分离菌株 检验过程监控菌株 环境菌（近期、远期） 现场调查收集菌株,鉴定与相似性分析相结合,传统方法与新技术相结合,不同方法的交叉验证,中国药品生物制品检定所,33,微生物来自哪里？,相似性分析同源性分析脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR）,中国药品生物制品检定所,34,Sample Preparation,Automated measurement after dryin
11、g of the samples!,2. Suspending,1. Harvesting,3. Loading,FT-IR Spektrum of microorganisms,图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系,中国药品生物制品检定所,35,The Infrared Spectrum,FT-IR spectrum is a fingerprint of the cells,Biochemical Structure of Cells,中国药品生物制品检定所,36,中国药品生物制品检定所,37,溯源性分析例1欣弗事件,图29 欣弗培养物,图30 欣弗培养物分离菌株镜检,中国药品生物制品
12、检定所,38,中国药品生物制品检定所,39,溯源性分析例1欣弗事件,头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus capitis ssp capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus cohnii ssp cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。,监测到的环境菌株,中国药品生物制品检定所,40,溯源性分析例2,双黄连注射液,利巴韦林注射液,F
13、TIR相似性分析,DuPont RiboPrinter基因指纹分析,中国药品生物制品检定所,41,几点思考,（1）、怎样才算是同一株菌？需要深入认识微生物本身微生物变异与保守的相对性；分析方法的可变性与微生物本身的可变性；生物学先锋琳恩马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。,中国药品生物制品检定所,42,几点思考,（2）、什么是最适宜的技术？需要深入认识分析微生物的技术和手段形态学分析与相似性分析（生化反应谱、片段相似性、FTIR光谱相似性等），在权衡方法本身的边界和微生物变异性边界的基础上，似乎更适合对亲缘关系
14、下一个否定的结论，即排除法，在这个意义上是否可以引入化学分析的3概念、精密度概念？,中国药品生物制品检定所,43,4、几点思考,（2）、什么是最适宜的技术？16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于区分；变异率太高（高到普通传代、培养难以控制）则没有意义。但一般来说16sRNA cDNA序列水平具有确定意义，困难在于确定足够长。 溯源分析不仅仅是鉴定到种，而是到株，对菌株的稳定性认识？与之相关的技术粗放性问题。,中国药品生物制品检定所,44,4、几点思考,（3）、怎样下结论？分析的根本目的是要下一个结论以检验活动为中心、以检验过程为线索、以实 验事实为依据，根据所有信息的综合分析能力。对阳性检出菌的技术分析最终要回到检验活动本身，技术分析结论,中国药品生物制品检定所,45,4、结果报告,综合分析 慎下不合格结论 不放过任何一个阳性信息,中国药品生物制品检定所,46,无菌/微生物限度检查理念,中国药品生物制品检定所,47,实验操作的标准化 验证试验的系统化 制定标准的严谨化 完备的实验室保障系统最终目标：一次检验即可得到准确结果。,中国药品生物制品检定所,48,谢谢大家！,
