1、石蜡块可以做常规 PCR一、石蜡包埋组织 DNA 提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取 DNA 的基本步骤，是在常规 DNA 提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织 DNA 提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含 SDS 和高浓度蛋白酶 K（mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得 DNA 虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA 释放和
2、蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的 DNA 分子，从而提 DNA 质量，适于做Sorthern 印迹杂交分析。Moerkerk 等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行 DNA 之点杂交结果一致，非螺旋化 DNA 亦不影响杂交分析。Goelz 氏 DNA 提取方法的主要步骤.切除多余石错，暴露组织.将组织切碎（最大径20kb） ，因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的 DNA。故 DNA 提取要求高，小片段 DNA 存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR ）则
3、可在相对粗制的小片段 DNA 存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR ）则可在相对粗制的小片段 DNA 样本上进行，分析所需的 DNA 很少，0.5g 甚至更少即可。PCR 的模板 DNA 制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ） 、 蛋白酶消化法（Impraimet al.1987 ；Brice,et al.1989） 。这些方法不经过酚氯仿异戊醇抽提、DNA 纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸 10min 或在蛋白酶缓冲液中消化h，DNA 即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进
4、行 PCR 扩增， 但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的 DNA，扩增率较低，且征对性不好。这可能是由于 DNA 附着的蛋白质去除不净而影响 DNA 变性和与引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对 Taq DNA 多聚酶的抑制所致。 二、影响 DNA 提取质量的因素1固定剂对 DNA 的影响固定剂的类型直接影响提取 DNA 的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA 保存完好，可以获得高分子量 DNA。Watford 等（1988）对甲醛固定过程中 DNA 变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；数天后碱基对
5、间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA 提取过程中的蛋白产 K 消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的 DNA 某些理化性质改变。Barmwell 等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得 DNA 产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致 DNA 明显降解。Michels 运输保存液或PBS 存放组织虽提取 DNA 纯度高，但产量得明显降低。Dubeau 等也观察到含苦味酸（Bouin 氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker ，Bs ）处理标本不能获得完整的 DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu 等（1990）用无水乙醇固定标本 48h，最长达 2 年，均可得到中量
6、的高分子 DNA。每 mm3 乙醇固定标本平均 DNA 产量为 26.6g，高于新鲜标本（19.4/mm3） 。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织 DNA 均显示由于重复 DNA 序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织 DNA 均显示由于重复 DNA 序列存在所产生的特性卫星带，说明 DNA 被完全消化。Southern 印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato 等（1990）用 AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量 DNA 完好无损。其基本方法为：将组织放至 4丙酮浸透，移至20过夜。然后再用丙酮分别在 4和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次 15min，最
7、后 60真空浸蜡 23h，石蜡包埋。结果显示，每 10mgAMex 法处理的温重组织提得高分子量 DNA71.4?4.53g，与新鲜组织产量相当（70.4?3.76g） 。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示 AMex 法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于 DNA 降解、高分子量 DNA 减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的 DNA 保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。2固定时间对 DNA 的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与 DNA 几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这福尔马林介导
8、的甲基化直接影响 DNA 提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。然而，Goelz 等，没有发现固定时间对 DNA 提取量的明显影响。Dubeau 等认为组织固定时间太短或太长均会导致 DNA 的降解。该作者对固定 12h 到 5 天不同时间间隔标本的 DNA 提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable ）的高分子量 DNA 明显减少。固定 5 天后可螺旋化 DNA 提取率仅有 8。Warford 等也发现单细胞悬液经 30min 福尔马林固定后，DNA 产量减少到 30，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应模索选定。根据 Dubeau 等经
9、验，常规组织固定应在 12h 以上至 110h 之内。3固定温度等其他因素对 DNA 的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下 DNA 双股螺旋链表现为两条由氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到 65时，氢键开始断裂；约 90时，产生两条单链分子。最近，Koshiba 等发现福尔马林固定过程中的 DNA 降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4） ，可以明显改善 DNA保存。酸性环境中 DNA 的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致 DNA 的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构改变。当
10、pH 达到 2.5 惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使 DNA 双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现 N糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最多，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的 DNA变性。然而，既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下 DNA 亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解 DNA。福尔马林中 DNA 降解的机理及其预防有待于进一步研究。4组织处理过程对 DNA 的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的 DNA，其大部分分子量晨 100bp10000bp 之间，主要分布于 1
11、001500bp，仅约 1/3 的组织所提取DNA20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有： 组织从外科切除到固定之间的时间长短下一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；蜡块贮存的地间长短不一。虽然本所获得的 DNA 分子量大。可能蜡块中仍存在导致 DNA 降解的因素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致 DNA 弯性，而产生单链 DNA 片段。单链DNA 不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。三、提高 DNA 提取质量的方法1蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量
12、 DNA 的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在 DNA 提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。2DNA 提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织 DNA 提取的质量和效益，人们不同方面进行了探索。其中在 DNA 提取液的改良，蛋白酶的消地间的 DNA 纯化等问题上取得了进展。DNA 提取液主要为含 SDS 和蛋白酶 K 的 TE 缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得 DNA 与蛋白质不易分离。因此，必须增加 SDS 和蛋
13、白酶 K 的浓度和作用时间：SDS 可增至 1-2，蛋白酶 K 可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba 等尿素和胍（guanidine ）是 DNA 自然和人工交联最有力的剥脱剂，2巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对 DNA 提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和 2羟基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得了高质量DNA。DNA 释放率对于不同蝗组织类型是有差异的，最决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏） ，通过 24h 孵育 80以上DNA 可释放出来；相同量的 DNA 释放对于富含致密间质的子宫肌瘤
14、则需要 6 天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA 释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织 DNA 提取，蛋白酶 K 的孵育时间可作适当调整，以求大量地获取大分子 DNA。此外，对于 Dubeau 等提出的 DNA 提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。Dubeau 等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的 DNA，可通过搅起完整的 DNA 而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在 DNA 纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化 DNA 的量，杂交分析
15、显示，螺旋化 DNA 杂交信号强，而未螺旋化 DNA 信号减弱。因此，增加 DNA 螺旋化可提高提取 DNA 质量和杂交效率。但是，Moerkert 等认为未螺旋化 DNA 不影响进行点杂交分析。3免疫 DNA 机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切在 35m 薄片，使每一细胞都被切开但是，我们认为切片太薄，容易对过多地将 DNA 切断，影响高分子 DNA 的获得率。最好是采用 1520m 的厚切片，高浓度蛋白酶 K 消 24 天，使能达到细胞充分破碎、蛋白肖化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的 DNA 剪切。此外，在 DNA 释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的 DNA剪切。纯化 DNA 用 TE（pH8.0）溶解放 4保存即可，若短其不用时应-20冻存，但切忌反复冻融，以免 DNA 降解。
