1、MM_FS_CNG_0484 食品添加剂 酪蛋白酸钠MM_FS_CNG_0484食品添加剂酪蛋白酸钠1.适用范围本方法适用于以鲜奶脱脂，用酸点制的凝乳或由干酪素经氢氧化钠或碳酸钠处理，干燥制得的产品。在食品工业上做乳化、增稠用。2.技术要求2.1.外观和感官要求本品为乳白色粉末，无嗅、无味。2.2.项目和指标项 目 指 标蛋白质（以干基计） ， 90.0脂肪， 2.0乳糖， 1.0灰分， 6.0水分， 6.0pH 值 6.07.5砷（以 As 计） ， 0.0002重金属（以 Pb 计） ， 0.002细菌总数，个g 30大肠菌群，个100g 40致病菌 不得检出3.试验方法3.1.外观和感官
2、检查目视法观察其颜色，嗅其味。3.2.理化试验3.2.1.鉴别3.2.1.1.溶解性：缓慢分散于水，稍有混浊，可溶于沸水，不溶于乙醇。3.2.1.2.灼烧试验：取样品 0.1g 灼烧时冒烟，并发出特异的臭气，所余残渣溶于水，对石蕊试纸呈碱性。3.2.1.3.沉淀反应：取样品 0.1g，溶于 10mL 1molL 氢氧化钠溶液中，加乙酸使成弱酸性，产生白色絮状沉淀。3.2.1.4.颜色反应取样品 0.1g，溶于 10mL 1molL 氢氧化钠溶液中，加 1 滴 6.2硫酸铜溶液，摇匀，产生蓝色沉淀，液体呈紫色。取样品 0.1g，加水 5mL，摇匀，加 10 滴 68.5硝酸汞溶液和 1 滴 10
3、亚硝酸钠溶液，在水浴中加热 3min，膨润后在样品表面呈现褐红-紫红色。3.2.2.蛋白质3.2.2.1.试剂硫酸；硫酸铜；硫酸钾；硼酸：4溶液；氢氧化钠：30溶液；蔗糖；盐酸：0.1molL（0.1N）标准溶液；混合指示液：0.2的甲基红乙醇溶液（95， V V）和 0.1的甲烯蓝（次甲基蓝）乙醇溶液（95， V V）等体积混合。3.2.2.2.试验程序称取样品 0.3g（准确至 0.0002g） ，置于 500mL 凯氏烧瓶中，然后加入约 15g 无水硫酸钾、0.2g 硫酸铜和 20mL 硫酸，摇匀后，于瓶口放一小漏斗，使瓶倾斜成约 45角，置于有小圆孔的石棉板上，小火加热，待内容物全部炭
4、化并停止起泡后，加大火力，保持瓶内液体微沸，直至液体呈蓝绿色，澄清透明，并使整个加热沸腾时间保持90min，在加热期间应注意摇动烧杯避免过热。样品消化后，冷却至室温，小心加约200mL 水混合并再次冷却至室温。向 500mL 锥形瓶中加入 4硼酸溶液 50mL 和 4 滴混合指示液，混匀，将锥形瓶置冷凝管下并使其出口端浸入硼酸溶液中，用量筒向凯氏烧瓶中加 30氢氧化钠溶液80mL，在此期间应将烧瓶保持倾斜，并使氢氧化钠溶液沿壁流入形成一底层，立即将凯氏烧瓶与冷凝管相连，用小火加热煮沸蒸馏避免起泡，使大约在 30min 内收集150mL 馏出液，此馏出液的温度应在 25以下，在蒸馏结束前 2mi
5、n 移动锥形瓶，使冷凝管口离开液面，用少量蒸馏水冲洗管口，停止加热，并将洗涤水收集在锥形瓶内，用 0.1molL 标准盐酸进行滴定。按上述方法不加样品改加 0.3g 蔗糖进行空白试验。3.2.2.3.计算100（ V1 V2） C1.4Xm（100 A） 6.38 （1）式中： X 蛋白质的含量（以干基计） ，；V1 滴定样品消耗标准盐酸溶液的体积，mL；V2 滴定空白消耗标准盐酸溶液的体积，mL；C 标准盐酸摩尔浓度，molL；m 样品的质量，g；A 样品中水分的含量，；平行试验结果的允许误差为 0.2。3.2.3.脂肪3.2.3.1.试剂稀盐酸：取盐酸 27mL，加水稀释至 40mL；无水
6、乙醇；乙醚；石油醚。3.2.3.2.仪器和设备骆立氏脂肪浸油管。3.2.3.3.试验程序取充分混匀的样品 2.5g（准确至 0.0002g） ，置于 50mL 烧杯中，加 15mL 稀盐酸，小心加热溶解，静置冷却后加 10mL 乙醇，小心转移至骆立氏脂肪浸油管中，加 25mL乙醚剧烈振摇 1min，然后加 25mL 石油醚，振摇 30s，放置分层后从侧管放出上面液层，用干燥滤纸过滤，将滤液置已知重量的烧杯中，再用乙醚 15mL 及石油醚 15mL 重复提取 2 次，把上层液体合并到前面的烧瓶中，在水浴上蒸去乙醚及石油醚，其残留物在 98100干燥 4h 后称量。3.2.3.4.计算m1 m0X
7、1 m2100 （2）式中： X1 脂肪的含量，；m1 烧瓶和脂肪的质量，g；m0 烧瓶的质量，g；m2 样品的质量，g。平行试验结果允许误差为 0.05。3.2.4.乳糖3.2.4.1.试剂盐酸：0.1molL；冰乙酸：10（ m V）溶液；乙酸钠：1molL；苯酚：80（ m m）溶液，取 8g 苯酚和 2g 水混合加热混匀；硫酸；乳糖：2.00（ m V）溶液，称量 2.1050.001g 一水乳糖（相当于 2.00g 无水乳糖） ，置于 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀于 0保存。3.2.4.2.试验程序称取充分混匀的样品 1g（准确至 0.000 2g） ，置于 100mL
8、 锥形瓶中，加 25mL 水，置 6070水浴上，使其完全溶解（一般约 1015min） ，冷却后再加 15mL 水，0.1molL 盐酸溶液 8mL 和 10乙酸溶液 1mL（每加一种溶液后应充分混匀）静置5min，再添加 1molL 乙酸钠溶液 1mL，混匀，使酪蛋白迅速下沉，用干滤纸过滤，弃去最初几毫升滤液后收集滤液。用移液管吸取 2.0mL 滤液，置于 50mL 烧杯中，再用微量移液管添加 80苯酚溶液 0.2mL，置磁力搅拌器上混匀，并在 1s 内加入 5mL 浓硫酸，使充分混匀，静置15min 后在 20水浴中冷却 5min，用空白溶液作对比，在 490 nm 处测定溶液的吸光度。
9、若吸光度超出标准曲线的上限，则取适当稀释的 2mL 滤液重复上述操作（注意：若用稀释滤液，则计算公式需相应变动） 。3.2.4.3.空白溶液的制备不进行样品的溶解和过滤等操作，其余均按上述样品的测定，用同一仪器设备和同样数量的试剂，进行同样的操作制得空白溶液。3.2.4.4.标准曲线的制作吸取 2.00乳糖溶液 10mL，置 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度（溶液 A） ，取A 液 1mL、2mL 和 3mL 分别置 3 个 100mL 容量瓶中，并用水稀释至刻度以制备 3 种标准溶液，所得标准溶液的无水乳糖浓度分别为 20、40 和 60gmL。取 4 个 50mL 烧杯，向其中 3 个
10、分别加入以上三种标准溶液各 2mL，向第 4 个加2mL 水，然后按样品滤液的测定方法进行同样操作，最后用第 4 个作为参比液测定其他三种标准的吸光度，并以吸光度对无水乳糖液的浓度（gmL）作图。3.2.4.5.计算C150X2 m3106100 （3）式中： X2 样品的乳糖含量（以无水乳糖计） ，；C1 由标准曲线查得的样品溶液中无水乳糖浓度；m3 样品的质量，g。平行试验结果的允许误差为 0.05。3.2.5.水分3.2.5.1.试验程序称取样品 2g（准确至 0.0002g） ，置于 1021下干燥 3h，冷却，称重，反复至恒重。3.2.5.2.计算m4 m5X3m4 m6100 （4
11、）式中： X3 水分的含量，；m4 称量瓶和样品的质量，g；m5 称量瓶和样品干燥后的质量，g；m6 称量瓶的质量，g。平行试验结果的允许误差为 0.2。3.2.6.灰分3.2.6.1.试验程序称取样品约 1g（准确至 0.0002g） ，置于已干燥恒重的瓷坩埚内，先置电炉上炭化，再于高温炉内维持温度 82525，完全灰化至恒重。3.2.6.2.计算m7 m8X4 m9 m8100 （5）式中： X4 灰分的含量，；m7 坩埚和灰分的质量，g；m8 坩埚的质量，g；m9 坩埚和样品的质量，g。平行试验结果的允许误差为 0.2。3.2.7.pH 值取样品 1g，加水稀释至 50mL，在温度约 2
12、0时，用酸度计测定。3.2.8.砷 砷斑法3.2.8.1.原理概要在碘化钾和氯化亚锡存在下，将样品液中的高价砷还原为三价砷，三价砷与锌粒和酸产生的新生态氢生成砷化氢气体，通过乙酸铅棉花除去硫化氢干扰，再与溴化汞试纸生成黄色至橙色的色斑，与标准砷斑比较作限量试验。3.2.8.2.主要试剂与仪器3.2.8.2.1.主要试剂硝酸、硫酸、盐酸；硫酸（1mol/l）溶液：量取 28mL 浓硫酸，慢慢加入水中，用水稀释到 500mL；氧化镁、三氯甲烷、吡啶、无砷金属锌；20氢氧化钠溶液；15硝酸镁溶液；15碘化钾溶液（临用前配制，贮于棕色瓶内） ；40氯化亚锡溶液：称取 20g 氯化亚锡（SnCl 22H
13、2O） ，溶于 50mL 盐酸中；乙酸铅棉花：将脱脂棉浸于 10乙酸铅溶液中，2h 后取出晾干；吸收液 A：称取 0.25g 二乙氨基二硫代甲酸银，研碎后用适量三氯甲烷溶解，加入 1.0mL 三乙醇胺，再用三氯甲烷稀释至 100mL。静置后过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内备用；吸收液 B：称取 0.50g 二乙氨基二硫代甲酸银，研碎后用吡啶溶解，并用吡啶稀释至 100mL。静置后过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内备用。1酚酞乙醇溶液；砷标准溶液：称取 0.1320g 于硫酸干燥器中干燥至恒重的三氧化二砷（As 2O3） ） ，溶于 5mL20氢氧化钠溶液中。溶解后，加入 25ml 1mol/l 硫酸，移
14、入 1L 容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度。此溶液 1.00mL 相当于 0.100mg 砷。临用前取 1.0mL，加 1mL1molL 硫酸于 100mL 容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度。此溶液 1.0mL相当于 1.0g 砷。溴化汞试纸：将剪成直径 2cm 的圆形滤纸片，在 5溴化汞乙醇溶液中浸渍 1h 以上，保存于冰箱中，临用前取出置暗处阴干备用。3.2.8.2.2.仪器测砷装置：见图 2100ml 锥形瓶；橡皮塞：中间有一孔；玻璃测砷管：全长 18cm，上粗下细，自管口向下至 14cm 一段的内径约为 6.5mm，自此以下逐渐狭细，末端内径约为（13）mm，近末端 1cm 处
15、有一孔，直径 2mm，狭细部分紧密插入橡皮塞中，使下部伸出至小孔恰在橡皮塞下面。上部较粗部分装入乙酸铅棉花，长（56）cm，上端至管口处至少 3cm，测砷管顶端为圆形扁平的管口，上面磨平，下面两侧各有一钩，为固定玻璃帽用；图 21锥形瓶；2橡皮塞；3测砷管；4管口；5玻璃帽玻璃帽：下面磨平，上面有弯月形凹槽，中央有圆孔，直径 6.5mm。使用时将玻璃帽盖在测砷管的管口，使圆孔互相吻合，中间夹一溴化汞试纸，用橡皮圈或其他适宜的方法将玻璃帽与测砷管固定。3.2.8.3.过程简述3.2.8.3.1.样品处理干灰化法：本法用于不适合于湿法消解的样品。称取样品 1g（准确至 0.1g） ，于瓷坩埚中，加
16、 10mL 15硝酸镁溶液，再于上面覆盖 1g 氧化镁粉末，混匀，浸泡 4h，于低温或置水浴上蒸干，用小火加热至炭化完全，将坩埚移至高温炉中，在 550以下灼烧至灰化完全，冷却后取出，加适量水湿润灰分，再缓缓加入盐酸（11）溶液至酚酞红色褪去，然后将溶液移入 50mL 容量瓶中（必要时过滤） ，用少量水洗涤坩埚 3 次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀。每 10mL 样品液相当于 1.0g 样品。取相同量的氧化镁，硝酸镁，按上述方法做试剂空白试验。3.2.8.3.2.测定吸取一定量的样品液和砷的限量标准液（含砷 1.0 或 2.0g） ，分别置于锥形瓶中，加 5mL 盐酸（样品液中如含硫酸或
17、盐酸，则要减去样品液中所含酸的毫升数） ，加水至 30mL，再加5mL 15碘化钾溶液，5 滴 40氯化亚锡溶液，混匀，室温放置 10min。向上述锥形瓶中，各加入 3g 无砷金属锌，并立即塞上预先装有乙酸铅棉花及溴化汞试纸的测砷管，于 25放置 1h，取出砷斑进行比较，样品的砷斑不得深于砷的限量标准的砷斑。若样品经处理，则砷的限量标准也须同法处理。3.2.9.重金属3.2.9.1.原理概要在弱酸性（pH34）条件下，试样中的重金属离子与硫化氢作用，生成棕黑色，与同法处理的铅标准溶液比较，做限量试验。3.2.9.2.主要试剂和仪器3.2.9.2.1 主要试剂硝酸、硫酸、盐酸氨水；6molL 盐
18、酸：量取 50mL 盐酸，用水稀释至 100mL；1molL 盐酸：量取 8.3mL 盐酸，用水稀释至 100mL；6molL 氨水：量取 40mL 氨水，用水稀释至 100mL；1molL 氨水：量取 6.7mL 氨水，用水稀释至 100mL；pH3.5 的乙酸盐缓冲液：称取 25.0g 乙酸铵溶于 25mL 水中，加 45mL 6molL 盐酸，用稀盐酸或稀氨水调节 pH 值至 3.5，用水稀释至 100mL；酚酞指示液：1乙醇溶液；饱和硫化氢水：将硫化氢气体通入不含二氧化碳的水中，至饱和为止（此溶液临用前制备） ；铅标准溶液：称取 0.1598g 高纯硝酸铅，溶于 10mL 1硝酸中，定
19、量移入 100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。此溶液 1mL 相当于 1.0mg 铅。临用前用水稀释 100 倍，使成 1.0mL 相当于 10g 铅；1硝酸：取 1mL 硝酸加水稀释至 100mL。3.2.9.2.2.仪器50mL 纳氏比色管；所用玻璃仪器需用（1020）硝酸浸泡 24h 以上，用自来水反复冲洗，最后用水冲洗干净。3.2.9.3.过程简述3.2.9.3.1.样品处理一般样品可直接按“测定”进行测定，如 A 管的色度深于 C 管的色度，应先经样品处理。3.2.9.3.1.2.干法消解：本法适用于不适合用湿法消解的样品。称取样品 2g（准确至 0.1g） ，置于坩埚中，加入适量硫酸
20、浸润样品，小火炭化后，加 2mL 硝酸和 5 滴硫酸，小心加热，直到白色烟雾挥尽，移入高温炉中，于 550灰化完全，冷却后取出，加 2mL 6molL 盐酸湿润残渣，于水浴上慢慢蒸发至干。用 1滴浓盐酸湿润残渣，并加 10mL 水，于水浴上再次加热 2min，将溶液移入 50mL 容量瓶中，如有必要须过滤，用少量水洗涤坩埚和滤器，洗滤液一并移入容量瓶中，混匀，每 10mL 该溶液相当于 1.0g 样品。在样品灰化同时，另取一坩埚，按上述方法做试剂空白试验。3.2.9.3.2 测定A 管：吸取含铅量相当于指定的重金属限量的铅标准溶液（不低于 10g 铅）于50mL 纳氏比色管中（如样品经处理，须
21、同时吸取与样品液等量的试剂空白液） ，加水至 25mL，混匀，加 1 滴酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水 6molL 或 1molL 调节 pH至中性（酚酞红色刚褪去） ，加入 pH3.5 的乙酸盐缓冲液 5mL，混匀，备用。B 管：取一支与 A 管所配套的纳氏比色管，加入（1020）mL（或适量）样品液，加水至 25mL，混匀，加 1 滴 1酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水 6molL 或 1molL调节 pH 至中性（酚酞红色刚褪去） ，加入 pH3.5 的乙酸盐缓冲液 5mL，混匀，备用。c 管：取一支与 A、B 管所配套的纳氏比色管，加入与 B 管等量的相同的样品液，再加入与 A 管等量的铅标
22、准溶液，加水至 25mL，混匀，加 1 滴 1酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水（6molL 或 1molL）调节 pH 至中性（酚酞红色刚褪去） ，加入 pH3.5的乙酸盐缓冲液 5mL，混匀，备用。向各管中加入 10mL 新鲜制备的硫化氢饱和液，并加水至 50mL 刻度，混匀，于暗处放置 5min 后，在白色背景下观察，B 管的色度不得深于 A 管的色度，C 管的色度应与 A 管的色度相当或深于 A 管的色度。3.3.微生物检验3.3.1.细菌总数：见附录 1。3.3.2.大肠杆菌：见附录 2。3.3.3.致病菌：按 GB 4789.14789.28 进行测定。4.验收规则4.1.本产品应由生产
23、质量检验部门进行检验，生产厂应保证所有出厂的产品均符合本标准的要求。每批出厂的产品都应附有质量证明书。4.2.使用单位可按照本标准规定的检验规则和试验方法，对所收到的产品进行检验。4.3.取样方法：应从每批件数的 10中选取试样，小批时不得少于三件，每件取出的样品不少于 100g，迅速将所选取的样品混匀，取化验所需的三倍量进行化验分析。4.4.如果检验中有一项指标不符合本标准时，应重新自二倍量的包装中选取样品进行核验，产品重新检验的结果，即使只有一项指标不符合本标准要求时，则整批不能验收。4.5.如供需双方对产品质量发生异议时，应由仲裁单位进行仲裁。5.标志、包装、运输、贮存5.1.本产品分
24、20kg 和 5kg 二种包装。5.2.每种包装，均先将产品装入食品用聚乙烯袋，封口，外套塑料编织袋，并注明“食品添加剂”字样、产品名称、商标、批号、净重、生产日期及生产厂名称。5.3.装卸运输时应防止日晒雨淋，轻拿轻放，禁止与有毒物品混装、混运，一起堆放。5.4.本品应贮存于阴凉、干燥的地方，并垫离地面 10cm 以上避免受潮受热。5.5.本品保质期半年。6.来源：GB 1079789附录 1 食品卫生微生物学检验菌落总数测定1.适用范围本方法适用于食品中菌落总数的测定。2.主要仪器和试剂2.1.仪器温箱(361)、冰箱（04）、恒温水浴：461、灭菌刀或剪子与镊子。电炉、放大镜、菌落计数器
25、、均质器或乳钵、平皿（直径为 90mm）。广口瓶或三角瓶（容量为 500mL）、玻璃珠（直径约 5mm）。2.2.主要试剂营养琼脂培养基；磷酸盐缓冲稀释液；生理盐水、75乙醇。3.检验程序菌落总数的检验程序如下：4.过程简述4.1.检样稀释及培养4.1.1.以无菌操作，将检样 25g(或 25mL)剪碎放于含有 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1:10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以 800010000r/min 的速度处理 1min，做成 1:10 的均匀稀释液。4.1.2.用 1mL 灭菌吸管吸取 1:10 稀释
26、液 1mL，沿管壁徐徐注入含有 9mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成 1:100 的稀释液。4.1.3.另取 1mL 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1 支 1mL 灭菌吸管。361 482h检样做成几个适当倍数的稀释液选择 23 个适宜稀释度各以 1mL 分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数报 告4.1.4.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在做 10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1mL 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释
27、度做两个平皿。4.1.5.稀释液移入平皿后，应及时将凉至 46营养琼脂培养基(可放置于 461水浴保温)注入平皿约 15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL 稀释液的灭菌平皿内作空白对照。4.1.6.待琼脂凝固后，翻转平板，置 361温箱内培养 482h。4.2.菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。4.3.菌落计数的报告4.3.1.平板菌落数的选择选取菌落数在 30300 之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌
28、落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 2 以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。4.3.2.稀释度的选择4.3.2.1.应选择平均菌落数在 30300 之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表中例 1)。4.3.2.2.若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30300 之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于 2，应报告其平均数；若大于 2 则报告其中较小的数字(见表中例
29、2 及 3)。4.3.2.3.若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例 4)。4.3.2.4.若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例 5)。4.3.2.5.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告之(见表中例 6)。4.3.2.6.若所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，其中一部分大于 300 或小于 30 时，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例 7)。4.3.3.菌落数的报告菌落数在 100 以内时，按其实有数报告，
30、大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用 10 的指数来表示(见表中“报告方式”栏)。稀释度选择及菌落数报告方式稀释液及菌落数例次10-1 10-2 10-3两稀释液之比菌落总数个/g 或 mL 报告方式个/g 或 mL1 多不可计 164 20 16400 16000 或 1.61042 多不可计 295 46 1.6 37750 38000 或 3.81043 多不可计 271 60 2.2 27100 27000 或 2.71044 多不可计 多不可计 313 313000 310000 或 3.11055 27 1
31、1 5 270 270 或 2.71026 0 0 0 110 107 多不可计 305 12 30500 31000 或 3.1104检 样稀释乳糖胆盐发酵管361，242h不产气 产气大肠菌群阴性报告伊红美蓝琼脂平板361，1824h革兰氏染色革兰氏阳性乳糖发酵管361，242h不产气产气革兰氏阴性无芽胞杆菌大肠菌群阳性大肠菌群阴性 大肠菌群阴性报 告报 告 报 告附录 2 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定1.适用范围本方法适用于食品中大肠菌群的测定。2.主要设备和材料温箱（361）、冰箱（04）、恒温水浴（44.50.5）、天平、显微镜；均质器或乳钵、载玻片、平皿（直径为90mm）、玻璃
32、珠（直径约5mm）、玻璃仪器3.主要试剂乳糖胆盐发酵管；伊红美蓝琼脂平板；乳糖发酵管；EC肉汤；磷酸盐缓冲稀释液；生理盐水；革兰氏染色液。4.检验程序大肠菌群检验程序如下：5过程简述5.1.检样稀释5.1.1.以无菌操作将检样 25mL(或 g)放于含有 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以 800010000r/min 的速度处理 1min，做成 1:10 的均匀稀释液。5.1.2.用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内
33、，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。5.1.3.另取1mL灭菌吸管，再做10倍递增稀液，每递增稀释一次，换1支1mL灭菌吸管。5.1.4.根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。5.2乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。5.3.分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养1824h，然后取出，观
34、察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。5.4.证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5.5.报告根据证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。6.粪大肠菌群6.1.用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见5.2条)转种于EC肉汤管内，置44.50.2水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养242h，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分
35、别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置361培养1824h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。6.2.结果报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。大肠菌群最可能数(MPN)检索表阳性管数 95可信限1mL(g)3 0.1mL(g)3 001mL(g)3 MPN100mL(g) 下限 上限0 0 0 30 5 900 0 1 300 0 2 600 0 3 900 1 0 30 5 1300 1 1 600 1 2 900 1 3 120续表阳性管数 95可信限1mL(g)3 0.1mL(g)30.01mL(g)3MPN100mL(g)
36、 下限 上限0 2 0 600 2 1 900 2 2 1200 2 3 1600 3 0 900 3 1 1300 3 2 1600 3 3 1901 0 0 40 5 2001 0 1 70 10 2101 0 2 1101 0 3 1501 1 0 70 10 2301 1 1 110 30 3601 1 2 1501 1 3 1901 2 0 110 30 3601 2 1 1501 2 2 2001 2 3 2401 3 0 1601 3 1 2001 3 2 2401 3 3 2902 0 0 90 10 3602 0 1 140 30 3702 0 2 2002 0 3 2602
37、 1 0 150 30 4402 1 1 200 70 8902 1 2 2702 1 3 340续表阳性管数 95可信限1mL(g)3 0.1mL(g)3 0.01mL(g)3 MPN100mL(g) 下限 上限2 2 0 210 40 4702 2 1 280 100 15002 2 2 3502 2 3 4202 3 0 2902 3 1 3602 3 2 4402 3 3 5303 0 0 230 40 12003 0 1 390 70 13003 0 2 640 150 38003 0 3 9503 1 0 430 70 21003 1 1 750 140 23003 1 2 120
38、0 300 38003 1 3 16003 2 0 930 150 38003 2 1 1500 300 44003 2 2 2100 350 47003 2 3 29003 3 0 2400 360 130003 3 1 4600 710 240003 3 2 11000 1500 480003 3 3 24000注：本表采用3个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)，每稀释度3管。表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。
