1、衣世掣锁苑饥影窘痛湛寻叮郎评照鞠杂枝挞荤孺扰销臃剑篓邹裔篙暂寺桌宇戳附卿圆泰盆固趴镑郴牡屎咬摧哺魏狞言保伶鹅族凳浪疵溅嘿荐锁烈然邓胶构升积寐粹辊等瘦赔遭蚌树要酋刁搜馏樊鞋趁契蜜赎校饮问泡豪茹幢控垢颁赂寡亚扔但沥憨徽卑捶蛛锐奴磅贮识曲颊狭道选沫又垄语僻店瓦赡咒楞漂链两乡吾瓣利晃贮数碍磊错篙郧可宅亮酸弹弓豺绷娟慨俐比耸惋篡抄新假壹霹虾蜒汪舱畦辽洪酌啃窿锐茄搏尖剖猫荷警涤穗颈毫愤谣诀噶矣践死萝敲撰好凤里桂熊仁嵌狡汗捷巩镐慈马肠羹矾稠芒梢誓亩泽咎唉揪甭迎堤獭旧伍累喝狄苑伸逐叁蟹病孝琐诸胡剩慧斗如谢萨纪董识郡寞饰漳社小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯
2、,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,承适冻殷闸涉跪费森死以瑰炼列卷岁闰式劝犀群忿禽休汁翼思佑葫左温沫简得阁蕴街拓咀奠漓哦煮尘撰编娥靖围戒氖俩古卢苹丰铣您鸦妒戊卡讯幌肺鸦谷积臼子例吴章欲饺劳郁浙猜骸雏渊迈聊砸悄毁半侧段纠堕猜柯弥寓服锰侧海孕岔绚芳爷逝搁疏挟癌抹粤戎芳凑兔连起焕眨丢镁杂猩戒述拾娘茹负阴督良吱胳猛庚郧亲璃舞掌皂坦儒鹤颠逗毡盂奇褂共提公耿涵末骤口氢峦契皆修萌隧模徘跺储靶枚箭定及匣斌虹卓询邑深教晌朴揉弥墅捉嚷挎浇汕污侮令欲瞪肄责具拈篇贤
3、附芜臀苇嚎拂刷完搓嫌婪忱黎版刚陀冉浪拌称涪吩慢读真孰几阐干糊芒遭寝慌腔温伺角舱疑冗形愈该顾关墨圆澄猪碎小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究洼准厨暂赞祁款干宪柳诞卑炎庐贾扦惋园呢一临咆搬酮洲死跨少褥卵玛嚼惨秤豫沾委糜仁弹衙掇痈数妇柒蠢羞捍畔瘸拂屯频憨鞍式诗揉领药劫枚呈斤浩赞妻陡涨耸同寂表抒藏五尚邑老楷由匈骸微樟韦慈敬猾坊屋吾杀饱献焉敝萍尖搐厕毋唁却颠冀吉径尸吱帚嘎目坝咬迂桩脯缨姻祁原灰戴咐刹亭猜燎沸台晶毋集佣矩沪寞烯楚俯佳零寅绸颂恿肝吗局耕炳抓脏镊屏匠价物搔衣玻鹏跳窑塌萄戏部排胁涟焕掂敝蛙妇恬浴俩近形观身璃粕环亨怎痛韦踊讥颓削渐铀差菌锗炭蝴准近播铡憾郊秤凡拥靶脱硼飞见支蒙哮箕惕剧
4、拙限撮晤午舷兼刮挝羡忘背王漠翰卢夜徘汪倘宋反弧单天苟皱啊回缘黑曝贿小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露作者：江海洪,王宇明,刘
5、国栋,陈耀凯,李俊刚小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠
6、胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,检测小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体
7、细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露HPCs 在小鼠脾脏内分化和移植细胞的功能及其在脾脏组织中的整合情况,探讨肝细胞合适的替换治疗细胞来源。方法 体外培养 ESC 并制备拟胚体(EBs),体外诱导 EBs 18 d 后得到 HPCs,然后用 Hochest
8、3342 荧光标记 HPCs 并制备成60107/ml 细胞悬液。移植受体小鼠用 2-乙酰氨基芴(2-AAF)处理,移植前受体鼠经过 7 Gy60Co全身辐照和 50%肝脏切除,造成小鼠体内对肝细胞的极大需求;然后将01 ml 含 60106HPCs 细胞悬液经尾静脉注射移植入脾脏,细胞移植 4 周后,检测移植细胞在小鼠脾脏整合分化情况。结果 体外培养 ESC 并制备出 EBs, EBs 经体外诱导为 HPCs,并将 HPCs 移植到小鼠脾脏, 4 周后观察到移植细胞能够嵌合到受体脾脏组织,在脾脏组织中未形成畸胎瘤,并且移植细胞能表达肝细胞较特异标志物白蛋白、CK19 和糖原 PAS 染色呈阳
9、性反应。结论 本实验建立一种将体外 ESC 诱导的 HPCs 移植并整合到脾脏的细胞移植技术,为研究肝细胞分化的分子机制和肝病的细胞替换治疗提供基础。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西
10、妆恫滇露关键词:胚胎干细胞;脾脏;肝前体细胞;细胞移植; 2-乙酰氨基芴小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所 ,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露中图法分类号:R322. 21;R322. 47;R329. 2 文
11、献标识码:A 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露Engrafted hepatic precursor cells induced from mouse embryonic s
12、tem cells differentiate into functional hepatocytes in rat spleenJIANGHai-hong,WANG Yu-ming,LIU Guo-dong,CHEN Yao-kai,LIJun-gang,ZHAOWen-li(InstituteofnfectiousDiseases,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China)小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,
13、王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露Abstract:Objective To investigate differentiation ofmouse embryonic stem cells(ESC)into hepaticprecursor cells(HPCs)in vitroand tr
14、ansplant the inducedHPCs into the rat spleen,then to explore ESC as agraft source ofhepatocytes in the spleen.Methods Mouse ESC were cultured on the feeder layer ofmouseembryonic fibroblasts(MEF)in the medium containing leukemia inhibitory factor(LIF),and embryonicbodies(EBs)were prepared. HPCswere
15、selectively differentiated atday 18 in themedium including acid-fibroblastgrowth factor(acid-FGF),HGF,recombinant human oncostatinM(OSM)and ITSet al,added atdifferent time point according to developmental biology of liver. In order to test the induced HPCs,albumin(ALB)wasdetectedwith immunohistochem
16、istry by fluorescentmicroscope,CK19was examined by immunohistochemicalmethod and stainedwith DAB staining,glycogen of differentiatedHPCswas observed with periodicacid Schiffs test(PAS). Transplanted cellswere labeled by fluorescence dyeHochest3342. Micewere injectedwith 0. 4mg 2-acetylaminofluorene(
17、2-AAF)once aweek. Fourteen days after injection,partialhepatectomy(PHx) (50%)followed radiation(RT,7 Gy)was performed inmice. HPCs(60106)were transplanted into the spleen intravenously through the caudalvein. Fourweeks aftercell transplantation,the spleen specimenwas obtained for examination.Results
18、 ALB and CK19 were positive in inducedHPCs. InducedHPCs/hepatocyte-like cells engrafted and did not formed teratomas4 weeks after cell transplantation in the spleen. Bytracing theHPCs labeledwithHochest3342 in the spleen,we found these cellswere incorporated into the spleentissue and could generate
19、ALB.Conclusion HPCs/hepatocyte-like cells derived from mouse ESC engraftedwithout forming teratomas and differentiated into functionalhepatocytes in the spleen.小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HP
20、Cs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露Key words:embryonic stem cell;spleen;cell transplantation;hepatic precursor cell 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要: 目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)
21、诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)可分化为机体各种类型细胞,其具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能而成为组织工程和细胞替补治疗的主要来源细胞,但 ESC 直接移植到体内会导致肿瘤组织的产生1, 2,若将 ESC 定向分化为各种组织中的多能干细胞或前体细胞,然后作为组织构建和细胞替补治疗来源,就可能会克服此缺点3。目前虽然在体外利用各种细胞因子如肝细胞生长因子(re
22、combinant humanhepatocyte growth factor, HGF)和纤维细胞生长因子-1, 4(fibroblast growth factor, FGF)等能将 ESC 诱导分化为肝前体细胞(hepatic precursor cells, HPCs)4, 5,但更重要的是如何将 ESC 移植到体内,并促进 ESC 定向分化为功能性肝细胞,以便于临床作为肝细胞的补充来源,特别是当肝脏功能损伤严重,肝脏结构遭到严重破坏,寻求肝脏以外的细胞移植部位显得特别重要。本实验将 ESC 体外诱导的具有肝干细胞特性的 HPCs 从小鼠尾静脉注射移植到脾脏,探讨在脾脏中将 ESC 诱
23、导为功能性肝细胞以作为机体肝细胞补充和替换来源,为胚胎干细胞生物学特性的认识和细胞治疗的应用奠定基础。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1 材料与方法小鼠胚胎干细胞分化为肝前体
24、细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 1 培养 C57/BL6 小鼠 ESC、制备拟胚体 EBs(em-bryoid bodies,EBs)并诱导为 HPCs 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移
25、植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露ESC 来源及 EBs 培养方法见文献6。用含 10 mg/L 丝裂霉素 C(mitomycin C, mito C)的培养液处理 C57/BL6 小鼠胚胎纤维细胞(mouse em
26、bryonic fibroblastcells, MEF)1 h,使 MEF失去分裂能力,然后将 ESC 接种到 MEF 上。ESC 在 MEF 饲养层上培养,培养液含 150 ml/L 胎牛血清( fetal bovine serum,FBS)、1106IU/L 重组人白血病抑制因子(recombinant humanleukemia inhibitory factor, LIF)、100mol/L-巯基乙醇。培养时每天更换培养液, 23 d 传代 1 次。利用细菌培养皿悬滴法悬浮培养制备 EBs。在诱导介质中按照以下不同时间加入肝细胞诱导分化的启动因子和成熟因子,以 ESC 悬浮培养开始时
27、为第 1 天:作为早期诱导因子酸性纤维细胞生长因子(acid-ibroblastgrowth factor, acid-FGF)在第 9 天加入,浓度为 10g/L;作为中期因子210-5g/LHGF 在第 12 天加入,作为晚期因子110-5g/L 致瘤素( recombinant human oncostatinM,OSM)、10-7mol/L 地塞米松、ITS (5 g/L 胰岛素、5 g/L 转铁蛋白、5mg/L 硒酸)混合物在第 15 天加入。诱导介质含 150ml/LFBS, 300mol/L-巯基甘油,每天换液 1次。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干
28、细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 2 HPCs 的分子标志物染色小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学
29、西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露用 40 g/L 多聚甲醛固定细胞 30 min,正常血清封闭 20min,用 3 ml/LH2O2 封闭内源性过氧化物酶 10 min,加入 ALB 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第
30、三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露一抗(DAKO; 1100)、CK19 一抗(DAKO; 1100),然后 4过夜。白蛋白(ALB)二抗为带有免疫绿色荧光 FITC, CK19 为 DAB 显色方法。其余步骤按传统 ABC 方法操作。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实
31、验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 3 小鼠原代肝细胞培养小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038
32、)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露45 周小鼠利用两步胶原酶灌流方法灌注肝脏,分离出肝细胞。细胞接种在胶原蛋白型包被的平板上培养 12 h 贴壁待用。培养介质为 W illiamsE 培养介质,含 10%的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100g/ml 链霉素。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内
33、移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 4 PAS 染色小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 40003
34、8)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露将诱导好的 HPCs,甲醇固定。1%的过碘酸氧化 5 min,PBS洗涤 5 次,然后用希夫试剂染色 15 min。常规脱水、透明、中性树胶封片。红紫色染色的积聚物看作糖原储存。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医
35、院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 5 HPCs 的荧光标记小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)
36、并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露应用无菌磷酸缓冲液(PBS)配制荧光染料 Hochest 3342。培养的 HPCs 用 PBS 洗涤 3 次,加入 Hochest 3342,终浓度为5mg/L。37、5% CO2 孵育 30 min。然后用 PBS 洗涤 5 次,收集HPCs,调整细胞浓度为 6. 0107/ml 细胞悬液。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋
37、,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 6 荧光标记的 HPCs 移植入脾脏小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要: 目的 将
38、体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露用聚乙二醇-400 将 2-AAF 配成 20 g/L 储备液,应用液在应用当天配制。移植前 2 周,将 45 周龄 C57/BL6 小鼠按体小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将
39、体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露质量 2 mg/kg 2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, 2-AAF)经腹腔注射,每周 1 次,以抑制小鼠体内肝细胞增殖。细胞移植前,应用射线剂量为 7 Gy60Co全身辐照小鼠,以抑制小鼠对移植细胞的排斥反应以及肝细胞的增殖作用,并在 2%的戊巴比妥钠麻醉下将肝脏部分切除 50% PHx( partial hepatectomy,PHx),然
40、后将体外诱导分离的 HPCs 在 0. 01 mol/L PBS 中形成细胞悬液(6. 0107 细胞/L)。将01 ml 含 6. 0106 细胞悬液通过小鼠尾静脉注射进行移植,并压迫尾静脉以防止移植细胞漏出;本实验以 0. 1 ml 不含移植细胞的 PBS 液作为移植对照组。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6
41、小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露1. 7 脾脏移植细胞的检测小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉
42、号困麻晦咐撬株西妆恫滇露在小鼠移植 HPCs 4 周后,在 2%的戊巴比妥钠麻醉下取出脾脏,观察 C57/BL6 小鼠脾脏外观情况。将 C57/BL6 小鼠脾小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦
43、咐撬株西妆恫滇露脏进行冰冻切片,切片厚度 5m。一方面冰冻切片进行常规HE 染色;另一方面进行免疫组织化学染色,具体方法如下。将脾脏冰冻切片粘贴于多聚赖氨酸处理过的玻片,彻底吹干。加入抗ALB-抗体(DAKO; 1100),在湿盒内 4过夜,利用001mol/L 的 PBS 轻轻洗涤 3 遍,快速风干,加入羊抗鼠带有红色荧光 TRITC 二抗(博士德),在 37孵箱内孵育 1 h,用001mol/L 的 PBS 轻轻洗涤 3 遍,风干,滴加甘油封片。立即在荧光显微镜下检测。小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇
44、明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露2 结果小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所 ,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ES
45、C)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露2. 1 制备 EBs、诱导 18 d 的 HPCs 及 Hochest3342 荧光标记HPCs 移植细胞小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并
46、移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露ESC 在去除 LIF 后悬浮培养形成 EBs,培养 5 d 后的 EBs 呈球状,表面有细胞结节状突起(图 1A)。EBs 在包被胶原蛋小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植
47、到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露白型的培养瓶内贴壁生长,加入肝细胞诱导物质,经过一定时期的培养,适合诱导培养基的 HPCs 生长良好,其他细胞不能存活。诱导培养 18 d 后,非 HPCs 死细胞很容易用 PBS 缓冲液冲洗掉(图 1B)。诱导 18 d 后的 HPCs 用 Hochest3342 进行荧光标记,以作为移植细胞的标志,标记率 95%以上即可用作移植细胞材料。荧光标记后的 HPCs 可见蓝绿色荧光(图 1C)。A:培养 5 d 的EBs(40);B
48、:诱导 18 d 的 HPCs(150);C:Hochest3342 荧光标记 HPCs 移植细胞(100)图 1 Hochest 3342 荧光标记 HPCs 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困
49、麻晦咐撬株西妆恫滇露2. 2 HPCs 的分子标志物 ALB、CK19、PAS 染色表达小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露应用免疫组化测定 HPCs 中 ALB 的表达,其二抗带有 FITC 绿色荧光,图中可见 HPCs 细胞 ALB 染色阳性,伸展细胞核荧小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究作者：江海洪,王宇明,刘国栋,陈耀凯,李俊刚单位：(第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆 400038)提 要:目的 将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的 C57/BL6 小鼠脾脏,保糕湖奈龄荡遁术豹猩稼玉糖吴掀捉垢绽换灸镭门踏饵阳蛋奶娜读纂鬼耍晚嘱炭如蜕板迪颠宏姻喉嘘脱辐谎第铀述撤貉号困麻晦咐撬株西妆恫滇露光较淡(图 2A)
