1、免疫酶组织化学技术,第二部分,非标记抗体免疫酶法(1969 Sternberger ),一、酶桥法（抗酶抗体法） 二、PAP法 (1970Sternkerger 等） 三、双PAP法（1975Vaeca 等） 四、APAAP多聚螯合物酶法,非标记抗体免疫酶法,Sternberger （1969）在酶标抗体法的基础上，创建了非标记抗体免疫酶技术。酶标抗体，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。,非标记抗体免疫酶法,先用酶（HRP 或AKP）去免疫动物（羊、兔和鼠等），
2、使其产生高效价、特异性的抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，没有一个抗体受到共价键的标记，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。,一、酶桥法,原理：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。 反应层次（四步法）：抗原第一抗体 第二抗体（桥抗体） 抗酶抗体 HRP DAB+H2O2 有色沉淀物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP底物,酶桥法,酶桥法,注意点 第一步 桥抗体必须对特异性抗体（一抗）、抗酶抗体，均具特异性，才能连接两者 抗原特异性
3、抗体、抗酶抗体由同一种属动物产生 第二步 桥抗体应过量，当与特异性一抗结合后，仍有剩余的抗原结合位点，使结合抗酶抗体，最后使酶通过免疫学原理与抗酶抗体结合,酶桥法,特点 用抗酶抗体 采用免疫反应原理（避免化学交联对酶抗体活性的影响） 一抗与抗酶抗体为同一种动物 二抗作为桥抗体连接二种IgG （ 同种动物） 优点 对酶活性及抗体效价影响小 非特异性染色比间接法轻 提高了灵敏度 缺点 手续较多，时间长,染色步骤1）4）同酶标抗体直接法。5）适当稀释的特异性一抗（例如来自种属A ) 37 孵育60min 或4过夜，PBS 洗33min。6）第二抗体（也称桥抗体，抗种属A 的IgG 抗体）37 孵育4
4、0min，PBS洗33min。7）抗酶抗体（来自种属A ) 37 孵育40min，PBS 洗3x3min。8）酶（HRP 70100g/ml，PBS 溶解）37 孵育40min，PBS 洗3x3min。9）显色复染同酶标抗体直接法。因该方法比PAP 法麻烦，现已被PAP 法所取代，故很少应用。,二、PAP法,酶桥法虽克服了酶标记抗体法的某些缺点，有效地保护了抗体及酶的活性，但抗酶抗体必须高度纯化，否则将降低其敏感性。 一是由于抗酶抗体血清中含有高亲和力和低亲和力两种抗酶抗体 抗酶抗体血清中的非特异性抗体虽不能与酶结合，但能与第二抗体（桥抗体）结合，从而减少了抗酶抗体的结合，也影响到方法的敏感性
5、。,PAP法,Sternkerger 等（1970 ）在此基础上进行了改良，建立了辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法 原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物 步骤：三步法将酶桥法的第，步合并为，用复合物代替 现将抗酶抗体和酶可溶性酶复合物 常用事先制备好的PAP进行免疫酶染色 故称PAP法（现有试剂：鼠、兔、羊PAP）,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,HRP底物,PAP法,PAP法,酶与抗体的比例 个酶分子与个抗酶抗体结合形成亚单位构成环形体 优点 抗原稍过量，所有的抗HRP 抗体均参与形成可溶性PAP 复合物敏感性高 背景着色低（PAP 为复合物，不存在游离免疫
6、球蛋白） 步骤简化（染色） 缺点 PAP 制备复杂，步骤多，时间长,染色步骤 1） 4m 石蜡切片58 烤片4h，切片常规脱蜡至水。 2）蛋白酶消化或AR （组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3）0.3 % H2O2 处理切片20min （室温），PBS 洗3min2次 4）3正常动物血清处理切片30min （室温），吸去多余血清，不洗。 5）适当稀释的特异性一抗孵育（4 过夜或37 60min) ，PBS洗3min3 次 6）滴加桥抗体（二抗），37 孵育40min，PBS 洗3min3。 7）适当稀释的PAP 复合物（要求与特异性一抗同一种属）37 孵育40min。 8）PB
7、S 洗3min 3。 9）0.04 % DAB-0.03 % H2O2显色812min。 10）水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。,三、双PAP法,原理：Vaeca 等（1975）建立了双PAP 法（double bridge PAP method） ，其基本原理是在PAP 法的基础上重复第二抗体和PAP 复合物，重复的连接抗体和PAP 复合物可能有两种连接方式 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物,组织抗原,第一抗体,第二抗体,PAP复合物,HRP,双PAP法,第一种重复连接抗体与特异性一抗分子上未饱和的Fc 段相结
8、合，第一抗体上结合了更多的桥抗体和PAP 复合物。,双PAP法,双PAP法,第二种重复连接抗体可与一个PAP 中的抗HRP 抗体上未饱和的Fc段结合，再与后加的PAP 复合物相结合,双PAP法,步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特异背景重 其染色步骤是在单PAP 法步骤18）的基础上重复68）步，然后继续以下操作。 9）常规DAB-H2O2显色。 10）水洗、复染、脱水、封片。 注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。,四、APAAP法,免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶（AKP 或AP）取代HRP 来显示结果的免疫酶组织化学技术。 1983 年Moson及Moir等
9、建立了碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶( APAAP ）复合物法。,APAAP法,原理 与PAP 法类似，所不同的是用AKP 取代了HRP 。该方法较IAP 法敏感性高，特别是用于标记固定过的组织。 抗原-特异抗体-第二抗体- APAAP复合物 步骤：三步法 一抗组织抗原形成复合物 二抗起桥联作用 抗碱性磷酸酶抗体与碱性磷酸酶复合物,APAAP法,APAAP法,注意点（同PAP 法） 一抗与第三抗必须来源于同一种属动物 二抗必须过量 优点 ALP 免疫组化染色，不受内源性过氧化物酶干扰，处理内源性ALP 较易 红色易与色素颗粒区别（用坚牢红时） 应用 含丰富内源性过氧化物酶的冷冻切片的首选方法（淋巴组织
10、、肿瘤组织） 皮肤病理学中应用，可与黑色素相区别,多聚螯合物酶法,许多年来，很多研究者都在努力使IHC 方法更敏感、更稳定、更简单，要求多步检测系统简化，但敏感性要进一步提高，使这一技术面临巨大的挑战。 一种新的多聚赘合物酶二步法在1995 年被隆重推出，该方法与简单的二步法相比较，具有很高的敏感性、稳定性和特异性。,多聚螯合物酶法,HRP-多聚螯合物-抗体 以碳为骨架 以多聚糖 以氨基酸类为骨架,主要用于PowerVision 法，它可以折叠，其复合物颗粒小于EnVision 试剂，其敏感性好于EnVision 法。,主要用于UIP （universal immunoperoxidase p
11、olymer ）法，其敏感性基本与PowerVision 法相同。,多聚螯合物酶法,多聚螯合物酶法,一、EPOS法Enhanced polymer one-step staining 原理：以具有惰性的多聚螯合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和HRP结合在一起，形成特异性EPOS试剂，一步法完成,EPOS法,原理：形成HRP-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物，该复合物内不含第二抗体及亲和素，染色时，只需在组织切片上加入相应的酶标记特异性抗体EPOS 试剂，孵育3060min 即可完成。勿需再加酶标记第二抗体,EPOS法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 法操作流程如下。 1）石蜡切片
12、常规脱蜡至水，PBS 洗3min3 次。2）蛋白酶消化或抗原修复（AR ) ，PBS 洗3minx3 次。3）0.3 过氧过氢（H2O2）处理5min。4）蒸馏水洗，置于PBS 中洗5min。5）加入相应的Dako EPOS / HRP 试剂，室温孵育3060min。6） PBS 洗3min 3 次。7）0.04% DAB-0.03% H2O2 显色812min。8）水洗，复染，常规树胶封片。,EPOS法,步骤：一步法 特点：目前最简便的方法，快速，特异性强，基本无背景染色 ，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵,二、EnVision法（ELPS法）,Enhanced Labelled Polymer System 原理：抗原抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物（葡聚糖）酶复合物（EnVision 复合物），与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,ELPS法,特点： 敏感性高：（1 mol复合物中含70mol HRP和10 mol第二抗体） 特异性强：复合物内无内源性多聚化合的 干扰 缺点：最大的缺点是葡聚糖骨架不能折叠，聚合物颗粒大，易形成空间位阻，细胞膜或核膜穿透较困难，影响方法的敏感性，有时会出现染色不均一。干扰。,谢谢,
