1、酶工程与发酵工程1固定化树干毕赤酵母细胞酒精发酵实验一、实验目的掌握海藻酸钙固定化细胞的制备；掌握海藻酸钙固定化酵母细胞的增殖培养；熟悉增殖培养基的配制、灭菌。用固定化酵母细胞进行酒精发酵，并测定发酵所得的酒精度和产物。二、实验原理固定化酶（细胞）是将酶或细胞通过物理或化学方法固定在某一载体上或限定在一定空间范围内，而酶（细胞）的活性保持不变，并能反复利用，易与反应液（醪液）分离，催化效率高。固定化酶（细胞）在固相状态下作用于底物，尤如离子交换树脂，有一定的机械强度，能用装柱或搅拌形式与底物溶液接触。固定化酶（细胞）与游离酶（细胞）相比具有许多优越性，如酶（细胞）活性保持不变，酶（细胞）致密地
2、分布在载体表面，催化效率高，能反复利用，易与醪液分离，省去了离心设备，简化了工艺。固定化酶（细胞）技术是目前生物工程的前沿技术，具有广阔的发展空间。固定化酶的研究始于 50 年代。因微生物酶有胞外酶和胞内酶之分。胞外酶由微生物细胞合成后分泌到培养基中；而胞内酶在整个培养过程中始终保留在细胞内或细胞表面，只有当细胞裂解后才能释放至培养基中。因此，在使用胞内酶时，应先将其从细胞中提取出来。有些胞内酶在提取、固定化过程中还会失去活性，提纯过程复杂，故提高了成本，给固定化酶带来许多不便。另外，有些酶促反应需要多步完成，固定一种酶并不能满足工艺需要。因此，由固定化酶发展到将整个细胞固定化起来，即微生物细
3、胞固定化，其优点是能避免复杂的酶提取和纯化过程，并解决了酶的不稳定性问题。细胞固定化后，酶活性高，操作稳定性好，能在多步酶促反应中应用并易于连续化、自动化操作。固定化细胞的研究要比固定化酶晚 10 年，但其发展更为迅速，应用也较为广泛。微生物细胞固定化常用的载体有：（1）多糖类，如纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、海藻酸钙、K-角叉胶、DEAE- 纤维素；酶工程与发酵工程2（2）蛋白质，如骨胶原，明胶；（3）无机载体，如氧化铝、活性碳、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶；（4）合成载体，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂。微生物细胞固定化常用的方法有三大类。1. 吸附法吸附法是将细胞直接吸附于惰性
4、载体上，分物理吸附法与离子结合法。(1)物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附。(2)离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法优点是：操作简便、载体可再生。缺点是：细胞与载体的结合力弱，pH 、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。2. 包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而底物和产物可以进入和渗出。细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态。目前微生物细胞的固定化大多采用包埋法。3. 共价交联法是利用双功能或多功能交联剂，使载体和酶或微生
5、物细胞相互交联起来，成为固定化酶或固定化细胞。常用的交联剂是戊二醛，这是一种双功能的交联剂，在它的分子中，一个功能团与载体交联，另一个功能团与酶或细胞交联。此法最为突出的优点是固定化酶或细胞的稳定性好，共价交联剂和载体都很丰富。海藻酸钠与微量酵母菌混合后滴加至 CaCl2 溶液中，形成 23 mm 的凝胶颗粒，再通过增殖培养，酵母菌能致密地分布在凝胶表面，即可进行固定化细胞酒精发酵。三、仪器、材料（一）仪器1、高压灭菌锅2、酒精灯酶工程与发酵工程33、电子天平4、摇床5、水浴锅（二）主要材料1、酿酒酵母2、5ml 针筒、3、250ml 三角瓶4、5ml 量筒5、小烧杯6、棉花塞（或封口膜）7、
6、牛皮纸8、药匙9、橡皮筋（三）主要药品1、海藻酸钠2、琼脂3、葡萄糖4、木糖5、蛋白胨6、酵母汁7、微量元素（FeSO 4、KH 2PO4、CaCl 2、MgSO 4）三、实验步骤：1d酵母活化：(准备实验，5 瓶)周一、二培养基：木糖 20g/l;蛋白胨 5g/l；酵母浸膏 3g/l;灭菌：木糖 121,20min 1g +25mlH2O蛋白胨和酵母浸膏：121,20min 0.25g 蛋白胨+0.15g 酵母浸膏+25mlH2O培养瓶：50ml/250ml; 封口膜一层；接两环酶工程与发酵工程4培养条件：30 ；170 rpm；24hr；2d酵母增殖：周三（配培养基）培养基：木糖：葡萄糖（
7、1:2） 总糖 60g/l; 蛋白胨 3g/l；酵母浸膏 2.5g/l; +5ml营养盐浓液营养盐： CaCl2 0.25g/l; MgSO4 0.25g/l; KH2PO4 2.5 g/l灭菌：木糖 +葡萄糖 121,20min 1g +2g+25mlH2O蛋白胨和酵母浸膏：121,20min 0.15g 蛋白胨+0.125g 酵母浸膏+20mlH2OCaCl2 浓液; 2.5g+200ml 121,20minMgSO4 浓液： 2.5+400ml 121,20minKH2PO4 浓液 25g +400 121,20min灭菌后营养盐混合制成营养盐浓液固定化细胞制备：1、称取 2.04g（3
8、%）海藻酸钠于 250ml 锥形瓶中，量取 68ml 蒸馏水倒入装有海藻酸钠的锥形瓶，将锥形瓶置于温水浴中（70-80） ，并用玻璃棒不断搅拌使海藻酸钠溶解充分溶胀。用封口膜封口，橡皮筋扎紧，置于高压灭菌锅中，于 121、0.1MPa 下，灭菌 20min。冷却后，取出。2、称取 1.4g（2%）CaCl 2 溶于 70ml 蒸馏水中于 250ml 锥形瓶中，用封口膜封口，橡皮筋扎紧，置于高压灭菌锅中，于 121、0.1MPa 下，灭菌20min。冷却后，取出3、固定化酵母细胞的制备：在无菌条件下（酒精灯边） ，用灭过菌的 10ml量筒量取 2ml 菌液加入到冷却海藻酸钠溶液中并混匀。用灭过菌
9、的 20ml 注射器，将所有混有酵母菌液的海藻酸钠滴加到 2% CaCl2 溶液中，边加边摇动三角瓶，制成凝胶颗粒，置于 4冰箱中固定化 12-24h。3d（周四）10、用冷无菌水清洗固定化凝胶颗粒 3 次（每次用约 50ml 的无菌水） ，将凝胶颗粒加入到 50ml 增殖液中（量筒中） ，至 80ml（保证固定化颗粒 30ml） 。酶工程与发酵工程5培养瓶：50ml/250ml; 封口膜一层；培养条件：30 ；150 rpm；24hr；培养结束后倾尽增殖培养液，4d 周五发酵固定化细胞发酵培养基：培养基：木糖：葡萄糖（1:2） 总糖 60g/l; +5ml 营养盐浓液+2.5ml 柠檬酸缓冲液营养盐： (NH4)2SO4 5g KH2PO4 3gMgSO4 0.5g+100ml 水灭菌：木糖 +葡萄糖 +柠檬酸缓冲液 121,20min1g +2g+2.5ml+42.5 mlH2O营养盐浓液; 121,20min两者灭菌后，无菌条件下 5ml 营养盐加入培养基增值后固定化细胞倒入发酵培养基（无菌）培养瓶：50ml/250ml; 封口膜一层；培养条件：30 ；150 rpm；24hr；(3hr,)总糖：10 g/l; 酒精：21g /l周五送去测样 HPLC
