1、东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210009 1巨噬细胞移动抑制因子活性机制与炎症性疾病东南大学附属中大医院麻醉科 汪福洲 景亮 南京,210009巨噬细胞移动抑制因子（MIF）作为一种多能细胞调节蛋白，是与多种疾病有着密切关系的“新型分子” 。尽管最初因 MIF 能够抑制豚鼠巨噬细胞随机移动而得名，但随着 MIF 在机体生命活动中一系列生理及病理生理作用的相继确认，已激起了对其在体内多种疾病病理过程中重要调节作用的高度关注。现今认为，MIF 是集细胞因子、神经内分泌激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，虽然 MIF 只占脑垂体分泌总量的 0.05%，但其可能是生物体系统性应激反应整体的一个重
2、要调节部分。大量资料显示 MIF 在细胞因子调节通路上与糖皮质激素（GC）一样起着控制“调定点”的作用。这里我们主要对 MIF 活性的分子机制、在炎症性疾病中是作用及可能的治疗学方法等方面的新进展作一介绍。1. MIF 分子结构和基因1.1 分子结构 MIF 的 cDNA 编码含 115 个氨基酸残基的蛋白质，其相对分子质量约为12.5kDa，跟其它蛋白相比并无明显生物序列同源性。放射图谱分析显示，人类与鼠 MIF 之间约 90%的氨基酸序列相同，MIF 晶体结构是由含 2 个反向平行 螺旋和 6 个 片层的三个单体组成的同源三聚体，形成一末端开放的中空结构。1.2 基因 人类 MIF 编码基
3、因位于染色体 22q112，含 3 个外显子 205、173 和183bp，2 个内含子 189 和 95bp。MIF 启动子包含多个 GC，不含 TATA 盒，说明其多个转录起始位点的存在。然而，多个组织 MIF mRNA 分析只显示出其单个转录位点的存在，约含800 个核苷酸，应用高显示液相染色体图谱分析技术说明了 MIF 基因存在多态性 1，其中CATT 重复元件包含 5-8 个等位基因，两个内含子多态位点位于+254（T/C）和+656（C/G ） 。2. MIF 生物学作用的分子机制2.1 MIF 的分泌与受体 用内毒素刺激单核细胞，显示 MIF 不经过内质网而是通过一非传统蛋白分泌
4、路径释放出胞。非传统蛋白出胞的典型抑制剂 Glyburide 和 Probenicid 能够强烈抑制 MIF 的分泌，说明MIF 分泌出胞时有 ABCA1 通道蛋白的参与 2。MIF 活性的发挥需与多种胞内蛋白相互作用，而这首先需要 MIF 信号的跨膜传递。克隆表达和功能分析发现 CD74 是 MIF 的高亲合力膜结合蛋白，起着 MIF 跨膜受体的作用。在重组可溶性 CD74 分子，MIF 结合于其 109-149 氨基酸残基部位，从而活化胞外 MAPK 信号传导、细胞增殖分化和前列腺素 E2 的产生 3。2.2 对糖皮质激素（GC）作用的调节东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210009 2
5、2.2.1 cPLA2机制 胞浆磷脂酶 A2（cPLA 2）及其活化后产物花生四烯酸是炎症反应的重要调节因子。GC 以 cPLA2为目标靶点，通过抑制其活化来达到抗炎作用的发挥。无论外源性MIF 的给予还是内源 MIF 的释放都能诱导静止成纤维细胞的活化增殖，此反应与丝裂源活化蛋白激酶（MAPK）亚家族 p44/p42 ERK 的持续活化相关，并且依赖于蛋白激酶 A（PKA）的活性。ERK 的信号传导引起一系列胞浆蛋白磷酸化，其中包括 cPLA2，c-myc 和 P90rsk。而 MIF 诱使cPLA2发生的磷酸化后活化最终是通过 ERK-MAPK 机制释放花生四烯酸来实现对 GC 的反向调节
6、。2.2.2 NF-B 途径 核转录因子-kappa B（NF-B）是炎性细胞因子基因表达的重要调节因子。而 GC 一方面通过抑制 NF-B 的 p65 亚单位与靶基因位点的结合而阻断 NF-B 转录活性；另一方面促进 NF-B 的抑制因子 I-B 的合成，从而胞浆 I-B 浓度增加使 NF-B/I-B 复合物形成增多而阻断 NF-B 向核内的转移来实现其抗炎作用。在内毒素刺激人外周血单核细胞实验中，MIF 显示出对 GC 诱导的 I-B 合成的抑制，从而使移入核内的 NF-B 增多引起促炎细胞因子和黏附分子基因表达。 2.2.3 Rb 调控 肿瘤抑制蛋白 Rb 的磷酸化受到上游分子周期素 D
7、1 的重要调节，当Rb 活化后引起转录因子 E2F 的释放，从而诱导 S-期急性酶的表达。在气道平滑肌细胞，GC 抑制凝血酶诱导的周期素 D1 mRNA 的表达、Rb 磷酸化和细胞增殖。同时 GC 可诱导血管平滑肌细胞及肺癌细胞分裂周期的停止并伴随有 Rb 磷酸化的明显下降 4。与 GC 相反的是，MIF 通过使Rb 磷酸化和 E2F 活性增加在整合素介导的细胞分裂过程中起着关键作用 5。这些表明周期素D1 的表达和 Rb 的磷酸化可能是 MIF 反向调节 GC 作用的关键点之一。2.2.4 AP-1 方式 GC 发挥作用的一个重要机制是其对活化蛋白-1（AP-1）调节基因的转录抑制，并且 G
8、C 抵抗性疾病与 AP-1 活性的升高密切相关。与其它许多生物现象一样，MIF的活性特征也呈现一“钟形”剂量反应曲线，高低水平的 MIF 可能产生明显不同的细胞调节效果。MIF 通过与 Jab-1 相互反应可能影响 AP-1 调节基因的转录活性，一方面 Jab-1 稳定 AP-1/c-jun 复合物与 AP-1 位点的结合；再者促进具有停止细胞分裂周期的 p27Kip1蛋白降解。然而，体内 MIF 过度表达时在抑制 Jab-1 促生长特性的同时使活化 AP-1/c-jun 复合物的稳定性下降 6。对 AP-1 稳定性的正负调节说明 MIF 在影响内外源性 GC 作用发挥的过程中处于相当重要的位
9、置。至此，MIF 反向作用于 GC 可能的分子机制包括：ERK-cPLA 2-花生四烯酸；I-B-NF-B-细胞因子；周期素 D1-Rb-E2F-细胞分裂；Jab-1-AP-1/c-jun-促炎基因- p27Kip1-细胞分裂。2.3 对 p53 因子的调节肿瘤抑制因子 p53 主要从两方面来阻止不适当的细胞增殖：诱导细胞分裂周期停止和凋亡。东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210009 3MIF 通过拮抗 myc-活性诱导的 p53 依赖的凋亡来保持巨噬细胞的存活及促炎功能。MIF 对 p53的抑制使肿瘤生长加快，炎症扩大 7。因此，MIF 促细胞生长的特性可能是参与多种炎症性疾病病理过程的
10、重要机制之一。2.4 生物活性酶特性三维晶体结构分析显示 MIF 和多种微生物活性酶一样具有相同的结构、酶促活性位点及保守的残基序列。MIF 具有右旋多巴铬互变异构酶、苯丙酮酸同分酶及硫醇蛋白氧化还原酶等酶促活性。三种酶活性催化不同的反应底物，说明 MIF 酶促位点可能对其生物学作用的发挥起着重要作用。3. MIF 与炎性相关疾病MIF 在炎症性疾病的发生发展过程中起着不容忽视的作用。与其它促炎细胞因子不同的是，MIF 以前体形式储存于包括垂体前叶细胞在内的多种细胞胞浆内，当受到应激刺激时迅速分泌出胞。循环 MIF 量增加，通过激活和促进 TNF-、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IF
11、N- 等炎性细胞因子表达，NO 的释放，COX-2 的诱导而直接促使炎症的发生和扩大。同时 MIF抑制和反向调节 GC 对免疫和炎性细胞活性的抑制及对炎性细胞因子释放的抑制来达到促炎的目的。败血症休克时炎性细胞胞浆内的 MIF 合成加强和聚集增加，与炎症部位炎性细胞的聚集呈现平行相关关系 8。在 ARDS，MIF 可能是通过中性细胞趋化性巨噬细胞炎性-2 因子的上调而发挥作用 9。人血管内皮细胞在 LPS 刺激后产生干细胞因子（SCF） ，由于 SCF 与 MIF 之间可能潜在着相互作用而激活和募集巨噬细胞，因此在炎症局部高水平 MIF 协同升高的 SCF 共同加强炎症反应。噬酸性粒细胞是 M
12、IF 的重要来源之一。在过敏性炎性疾病的发病过程中噬酸性粒细胞是重要的参与者。在过敏性炎症部位 MIF 蛋白的表达增加与噬酸性粒细胞的聚集密切相关。慢性炎性疾病如风湿性关节炎和肾小球肾炎等，其中 MIF 基因启动子的多态性与病情严重程度相关10，因此 MIF 的促炎功能直接影响炎性疾病的预后。4. 炎症性疾病时对 MIF 的相关治疗4.1 抗 MIF 抗体的应用对炎症性疾病的动物模型或病人给予抗 MIF 抗体处理，一方面炎性细胞在炎症部位的聚集减少，同时 GC 治疗的效果增加，并且在慢性炎症疾病时长期应用 GC 的必要性降低；另一方面病人的 28 天病死率明显下降，使病人的预后得到一定的改善。
13、Makita H 等应用 MIF 单克隆抗体预处理 LPS 刺激的老鼠发现其支气管内皮细胞和肺泡巨噬细胞 MIF mRNA 表达明显下降，中性粒细胞趋化因子 MIP-2/CINC-3 水平降低，肺组织中性粒细胞聚集减轻 11。抗 MIF 抗体可以使格兰氏阴性和阳性菌引起的致死率降低，从而增强对内外毒素的耐受，起到一定的保护作用 12。Calandra T 等通过盲肠结扎穿孔重症腹膜炎模型，应用重组 MIF 后症状加重，而抗 MIF 抗体东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210009 4的给予使其症状得到一定的改善，血浆中促炎性介质水平下降 13。因此，用 MIF 单克隆抗体中和 MIF 可以使
14、免疫细胞稳定性增强，抗炎性能加强，炎症得到一定好转，但其临床应用还需要进行大量临床前期实验。4.2 酶活性抑制剂的应用应用小分子量抑制剂与 MIF 催化活性位点结合来不可逆地抑制 MIF 的促炎作用可能是一种比较理想的治疗方案。亲电子烷化剂 NAPQIN-acetyl-p-benzoquinon imine，是乙酰氨基酚的氧化代谢产物之一，具有左旋二羟苯丙氨酸铬甲酯的亚氨基苯醌样功能，能和亲核试剂硫醇相互反应，但是硫醇的反应物碘乙酰胺和 N-乙烷顺丁烯二酰亚胺都不能抑制 MIF 的酶活性 14，而 Senter PD 等发现 MIF NH2末端的脯氨酸作为其主要亲核中心与 NAPQI 以共价键
15、相连，通过抑制 MIF 对 GC 抗炎作用的拮抗来达到对 MIF 蛋白的同分酶特性和促炎生物活性的抑制，并且呈现出浓度依赖性关系 15。异唑类衍生物 ISO-1(S,R)-3-(4-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid methyl ester在水溶液中具有高度稳定性，通过对 MIF/对羟苯丙酮酸复合物与氨基酸 Schiff-基化合物结构活性关系的分析显示 ISO-1 含有能和 MIF 催化活性位点结合的结构序列，当 ISO-1 与 MIF 结合形成 MIF/ISO-1 复合物后，MIF 互变异构酶的活性受到抑制；再者，ISO-1
16、 可以对 MIF 刺激胞浆磷脂酶 A2（PLA 2）活化而引起花生四烯酸产物释放的过程产生抑制；第三，ISO-1 能够阻抑 MIF 对 GC 的拮抗，从而达到一定的抗炎效果 16。这里 NAPQI 和 ISO-1 代表了小分子量化合物以细胞因子 MIF 为目标靶点，能够不可逆性抑制其促炎活性，从而为 MIF 相关性疾病的临床治疗新型药物的发现提供了可能。4.3 基因水平介入在神经内分泌系统基因易感性对 MIF 表达的加强可能是一个治疗相关的关键性决定因素，因此从基因水平 MIF 启动子的多样性入手，寻找合适的介入因子可能会对炎性疾病治疗策略的优化及 GC 应用的效果产生比较满意的结果。5. 需
17、进一步研究的问题5.1 分子机制方面（1）CD163 是血色素-结合珠蛋白复合物的受体，其在循环单核细胞表面的表达在 LPS刺激时明显增加，并且有利于 IL-10 的产生 17。接下来的研究应明确在循环白细胞表面 CD163的表达是否有结合珠蛋白诱导产生 MIF 的参与，以及其受体 CD74 在不同细胞上的表达情况；（2）ACTH 诱导 GC 分泌时，Ca 2+起着重要作用。因此，当机体处于应激状态时，H-P-A轴、ACTH、GC、MIF、Ca 2+之间是否存在着相互关系仍未明了。5.2 疾病病因学方面（1）不同病因引起不同疾病，在不同时期，MIF 的表达及炎性细胞的浸润与疾病发生发展的关系如
18、何，特别是与脏器功能的改变，疾病的预后转归的关系还有待进一步探讨。东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210009 5（2）感染性疾病时，机体循环机能明显下降，其中 MIF 是否发挥着致关的作用需待探讨。（3）GC 的抗炎抗免疫作用受到 MIF 的反向调节。炎性疾病时 GC 量的相对增加而效能的相对低下，即 GC 抵抗是否由于 MIF 的参与；同时，MIF 与 GC 的相互作用是否是以 GC 受体 GR 为联桥，即是否以 GR 为作用相联点尚需进一步实验说明。5.3 治疗学方面（1）GC 治疗是否诱导 MIF 生成细胞亚群的相对减少，以及 GC 治疗是否反映了 GC 对外周血单核细胞的功能影响需更进一步研究。（2）MIF 生物作用的发挥包括多种信号传导分子的参与，采用其相应的阻断剂是否会对MIF 作用的发挥产生一定的抑制效果需要实验验证。（3）MIF 生物酶活性本身是否包含在其生物活性当中以及 MIF 酶促位点是否起着未知受体结合点的作用都需要更进一步的实验来说明，将为 MIF 小分子量抑制剂的发现和研制提供可能。通过对多能分子 MIF 各个方面的探讨，阐明与疾病的潜在关系，将有助于对炎症性疾病发病学、诊断学及治疗学等方面的进一步认识和改进。
