1、拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王 云， 任永兵， 杨 硕， 韩 宇， 陶 杨， 曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMY
2、B61。利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究AMyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineeri
3、ng，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template toamplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment wassubsequently cloned into plant pUCm-T vectorThe results
4、of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfullyclonedAtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1and Bgl，andthe gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301The results of b
5、acterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAMBIA2301一AtM YB61In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacteriumtumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1gene
6、 was obtainedThe study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants andfurther exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 geneKey words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引 言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。但植物的抗逆应答是一系列相关基因连续
7、表达调控的极其复杂的调控网络。在整个调控网络中，转录因子能调控多个相关基因的表达，所以增强转录因子的调控是提高植物抗逆性更有效的方法。MYB转录因子是拟南芥中最大的基因家族。该基因家族主要在植物的生长发育方面发挥重要作用，如植物次级代谢、信号传导、器官形成等方面3。另外，也有一部分参与了逆境胁迫介导的细胞应答4 。大量研究证实，一些MYB转录因子的过量表达可以显著增加植物对逆境的耐受性L7 。MYB61转录因子具有DNA结合结构域和转录调节结构域，其功能相当广泛，参与重金属、低磷和干旱等胁迫的信号调节，植物重金属胁迫与氧化胁迫是相关的【9。AtMYB61基因在植物中过量表达，有利于进一步研究A
8、 MyB61基因的抗逆分子机理。因此，本文利用RT-PCR克隆AtMYB61基因，并构建了pCAMBIA2301一AtMYB61植物表达载体，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究AtMYB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。1 材料与方法11 材料111 植物材料哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株，由美国拟南芥种质资源库提供，后由本实验室繁衍，贮存。112 主要试剂限制性内切酶Eco91I(BstEII)为Fermentas公司产品；TransTaq Polymerase High Fidelity(HiFi)为北京全式金产品；DNA凝胶纯化试剂盒、T4DNA连接
9、酶及氨苄青霉素(进口分装)为大连宝生物公司产品；First-Strand cDNA Synthesis Kit购自上海申能博彩生物科技公司；EZ-10 Spin ColumnPlasmid Mini-Preps Kit购自BIO BASIC公司。其它试剂均为分析纯。113 菌株和质粒大肠杆菌DH5a由本实验室保存，农杆菌C58为中国科学技术大学提供；pUCm-T载体和pCAMBIA2301载体均为本实验室保存。12 方法121 拟南芥幼苗的培养用01的HgC12溶液浸泡种子3 min，去掉HgC12溶液，再用无菌水冲洗5次。然后将拟南芥种子点种于MS固体培养基上，置于4C冰箱中春化2 d后，转
10、置于光照强度为100nol(m2s)、2218。C、168 h光周期条件下培养14 d。122 常规分子克隆实验技术电泳、DNA切胶回收、酶切、大肠杆菌和农杆菌感受态制备、转化、质粒提取等操作方法参见文献1O。123 拟南芥AtM ，B6l基因的克隆采用Trizol法提取拟南芥幼苗总RNA。拟南芥cDNA合成以拟南芥幼苗总RNA为模板，采用First-Strand cDNA Synthesis Kit使用说明合成cDNA。拟南芥AtMYB61基因cDNA 的PCR扩增所用引物是根据GenBank中A 61基因mRNA序列，用Primer Premier 50软件设计，并在上游和下游引物的5 端
11、分别加入Bgl 1I、BstE1I酚切位点和2个保护碱基。上游引物：5-GA AGATCTATGCGAGACATTCTTGCTGTT-3 ；下游引物：5-CGCgTCACCCTAAAGGGACTGACCA-3 。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95预变性5 rain，94 变性30 S，54 退火30 S，72延伸90 S，共3O个循环，72延伸10 min，4。C终止反应。PCR产物经1 96琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化。拟南芥AtMYB61基因TA克隆与鉴定。将回收纯化的AMYB61基因DNA，用T4 DNA链接酶与pUCm-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含
12、有100 txgmL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑取单菌落在装有1 mL的LB和15 mL的20,gmL Amp离心管中37下培养810 h。取50 培养物，煮沸5 min，5 000 rrain，离心2 min后，取12 L上清进行PCR检测。菌落PCR 验证后的菌液抽提质粒，用双酶切(BstEU和BglII)切下目的条带，电泳检测，并回收纯化。将经抽提质粒双酶切(BstE和Bgl)并做PCR鉴定后的阳性克隆菌落摇菌，菌液送至上海生物工程公司测序。124 植物表达载体的构建(1)植物表达载体pCAMBIA2301和A一MYB61基因的重组。提取AtMYB61一pUCH卜T载体，并
13、用BstE和BglII完全双酶切切下目的基因片段，电泳检测并回收纯化。pCMBIA2301载体用BstEII完全酶切，电泳检测并回收目标载体片段，此载体片段再用BglII部分酶切，检测并回收目标载体片段。将该载体片段与目的基因片段用T4 DNA连接酶连接。(2)重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kVem；电容25 F；电阻500 Q。电击35 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至15 mL的EP管中，在28震荡培养3 h；取100,L菌液涂布于含Gen(50,gmL)和Kan(50,gmL)的L
14、B平板中28培养24 h，即可长出阳性克隆。(3)阳性pCAMBIA2301一AtMYB61克隆的菌落PCR与酶切鉴定。随机挑取单菌落，在装有1 mL的LB和15 mL的抗生素的离心管中28培养12 h左右。取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 rrain离心2 min，取12,L上清进行PCR扩增后电泳检测。选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。2 结果与分析21 A YB61基因cDNA的PCR扩增提取拟南芥幼苗总RNA，用高保真反转录酶反转录成cDNA，再用高保真DNA聚合酶扩增A 61基因片段。实验中所获得的目的片段与预期大小
15、一致，CDS+酶切位点1 114 bp，两端具有相应的酶切位点，如图1所示。2000 bp1 000 bp750 bp500bp250 bplo0 bp图1 AtMYB61基因cDNA克隆22 AMyB61基因TA克隆与鉴定目的基因与pUCm-T载体连接并将连接产物纯化，用热击法导人大肠杆菌DH5a感受态细胞中，用含100gmL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性单克隆。AtMYB61基因TA克隆菌落PCR和酶切鉴定如图2所示，实验结果表明，所挑选的几个单菌落均为含有重组质粒的阳性克隆，其大小1 101 bp，所用引物没有酶切位点。提取质粒，经双酶切(BstE lI和Bgl 11)后，电泳检测并回收。
16、其酶切产物与扩增产物经对比后发现大小基本一致，如图2b所示，其大小为1 113 bp。选取已验证菌液送至上海生物工程公司测序。测序结果表明，扩增结果与数据库中的核苷酸序列完全一致，表明高保真聚合酶的扩增准确无误，基因克隆正确。经完全双酶切(Bst EII和BglII)获得的目的基因片段，可用于植物表达载体的构建和转基因。图2 AtMYB61基因TA克隆菌落PCR和酶切鉴定23 重组T载体切下AMyB61基因选取AtMYB61一pUCm-T载体阳性克隆，摇菌培养，抽提质粒，用BstEII和BglII完全双酶切切下目的基因片段，如图3所示。电泳检测并回收纯化，大小为1 113 bp。载体被切成了大
17、小不等的几段，是由于目的基因的插入方向有2种造成的。酶切所得片段是带有酶切位点的黏性末端，可以和双酶切获得的表达载体片段直接连接。图3 重组T载体切下AtMYB61基因24 pCMBIA2301表达载体的酶切241 pCMBIA2301载体的BstE II完全酶切用BstE将pCMBIA2301环状载体酶切成线状如图4所示，产物用1 琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收酶切产物。结果表明，pCMBIA2301载体被酶切成了单一的线状，大小为11 633 bp。242 pCMBIA2301载体的Bgl lI部分酶切BstE酶将pCMBIA2301载体切成线状切胶纯化回收后，回收产物用Bgl II进行第2次酶切，由于pCMBIA2301载体上有2个Bgl酶切位点，因此必须用部分酶切来获得所需的载体片段。酶切时间和酶切体系须根据不同的酶和不同的酶切Buffer来调整，如图5所示。图5中用
