1、微 生 物 学 通 报 MAR 20, 2010, 37(3): 325330Microbiology China 2010 by Institute of Microbiology, CAS 基 金 项 目 ： 国家 973 计划项目(No. 2009CB724701); 国家自然科学基金项目(No. 20606017); 江苏省“青蓝工程”项目* 通 讯 作 者 ： Tel: 86-25-83587330; : 收 稿 日 期 ： 2009-11-02; 接 受 日 期 ： 2009-12-14研 究 报 告过量表达 Bacillus subtilis 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产
2、琥珀酸的影响于 丽 姜岷 * 马 江 锋 岳方方 刘 树 文(南 京 工 业 大 学 生 物 与 制 药 工 程 学 院 材 料 化 学 工 程 国 家 重 点 实 验 室 江 苏 南 京 210009)摘 要 : 在 大 肠 杆 菌 厌 氧 混 合 酸 发 酵 途 径 中 , 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶 (PPC)和 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮酸 羧 化 激 酶 (PCK)皆 可 催 化 由 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 (PEP)到 草 酰 乙 酸 (OAA)的 反 应 。鉴 于 经 由 PCK 催化 的 反 应 伴 有 ATP 的 生 成 , 理 论 上 更 有 利 于
3、 菌 体 生 长 和 产 酸 , 本 研 究 以 大 肠 杆 菌 W3110 (pfl, ldh)为 出 发 菌 株 , 利 用 -Red 同 源 重 组 系 统 构 建 了 其 ppc 缺 陷 菌 株 并 在 此 基 础 上 过 量 表 达 了Bacillus subtilis pck 基 因 。初 步 的 厌 氧 发 酵 实 验 表 明 : 过 量 表 达 pck 可 在 一 定 程 度 上 恢 复 初 始 菌 株厌 氧 代 谢 葡 萄 糖 的 能 力 。其 中 又 以 ppc 缺 陷 株 更 为 明 显 , 其 耗 糖 能 力 和 产 酸 能 力 分 别 为 对 照 菌 株的 4.2 和
4、 15.3 倍 。关 键 词 : 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 激 酶 , 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶 , 大 肠 杆 菌 , 琥 珀 酸Effect of Overexpression of Bacillus subtilis Phosphoenolpyruvate Carboxykinase on Succinate Production in Escherichia coliYU Li JIANG Min* MA Jiang-Feng YUE Fang-Fang LIU Shu-Wen(State Key Laboratory of Materials-Orie
5、nted Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing, Jiangsu 210009, China)Abstract: Both of the phosphoenolpyruvate carboxylase (PPC) and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) could catalyze the reaction from phosphoenolpyr
6、uvate (PEP) to oxaloacetic acid (OAA) in the pathways of anaerobic mixed acid fermentation for E. coli. In addition, the reaction catalyzed by PCK generates ATP, which is more beneficial to the growth of the strain and the succinic acid production theoretically. In this study, we constructed a ppc d
7、efective strain using -Red homologous recombination system with the E. coli W3110 (pfl, ldh) as the parent strain. Based on that, Bacillus subtilis pck was overexpressed. The preliminary anaerobic fermentation experiments showed that both strains partially recovered the ability to consume glucose th
8、rough the overexpression of pck. Besides, the ppc defective strain 326 微 生 物 学 通 报 2010, Vol.37, No.3http:/ the most excellent performance, the rate of glucose consumption and succinate production were 4.2 and 15.3 folds as much as those of the parent strain, respectively.Keywords: Phosphoenolpyruva
9、te carboxykinase, Phosphoenolpyruvate carboxylase, E. coli, Succinic acid琥 珀 酸 (又 称 丁 二 酸 ), 被 广 泛 应 用 于 医 药 、农药 、染 料 、香 料 、油 漆 、食 品 和 塑 料 等 行 业 , 同 时 , 作 为 优 秀 的 C4 平 台 化 合 物 , 可 用 于 合 成 1,4-丁 二醇 、四 氢 呋 喃 、-丁 内 酯 等 有 机 化 学 品 以 及 聚 丁 二 酸丁 二 醇 酯 (PBS)类 生 物 可 降 解 材 料 , 被 美 国 能 源 部认 为 是 未 来 12 种 最 有 价
10、值 的 生 物 炼 制 产 品 之 一12。利 用 微 生 物 发 酵 法 转 化 可 再 生 资 源 生 产 琥 珀酸 , 价 格 低 廉 、污 染 小 , 且 在 发 酵 过 程 中 可 吸 收 固定 CO2, 开 辟 了 温 室 气 体 利 用 的 新 途 径 , 近 年 来 成为 研 究 的 热 点 。琥 珀 酸 的 生 产 菌 株 很 多 , 目 前 主 要 集 中 在Anaerobiospirillum succiniciproducens3、Actinobacillus succinogenes4、Mannheimia succiniciproducens5 和重 组 E. co
11、li 上 。其 中 , E. coli 由 于 具 有 遗 传 背 景 清楚 、易 操 作 、易 调 控 、培 养 基 要 求 简 单 和 生 长 迅 速 等优 点 , 近 年 来 被 广 泛 用 于 研 究 以 获 得 产 琥 珀 酸 优 秀菌 株 。图 16显 示 了 大 肠 杆 菌 的 厌 氧 混 合 酸 发 酵 途径 。产 琥 珀 酸 大 肠 杆 菌 基 因 改 造 策 略 主 要 有 : 增 强代 谢 途 径 中 的 关 键 酶 (如 PPC)、失 活 或 敲 除 竞 争 途径 中 的 酶 (如 LDH、PFL)、引 入 新 的 代 谢 途 径 (如 乙醛 酸 循 环 )等 7。图
12、1 大 肠 杆 菌 厌 氧 混 合 酸 发 酵 途 径 6Fig. 1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation for Escherichia coli6其 中 , PEP 羧 化 酶 (PPC)基 因 (ppc)和 PEP 羧 化激 酶 (PCK)基 因 (pck)催 化 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 (PEP)与草 酰 乙 酸 (OAA)之 间 的 反 应 。Millard 等 8在 大 肠 杆菌 中 过 量 表 达 E. coli ppc 和 pck, 研 究 发 现 过 量 表达 ppc 可 以 使 琥 珀 酸 作 为 混 合 酸
13、发 酵 的 主 要 产 物 , 且 产 量 较 出 发 菌 株 提 高 3.5 倍 , 而 过 量 表 达 pck 对发 酵 结 果 没 有 影 响 , 但 在 ppc 缺 陷 菌 株 中 , pck 的 过量 表 达 能 够 提 高 琥 珀 酸 的 产 量 。因 此 , PPC 可 能 是催 化 PEP 至 OAA 的 最 主 要 的 酶 , 而 当 ppc 缺 陷 时 , PCK 可 催 化 该 反 应 。San Yup Lee 等 9在 大 肠 杆 菌 中过 量 表 达 E. coli pck, 结 果 表 明 当 培 养 液 中 HCO3的 浓 度 低 时 , 细 胞 中 的 羧 化
14、反 应 由 PPC 完 成 , 而HCO3浓 度 高 时 , 主 要 由 PCK 完 成 该 反 应 。向 培 养基 中 添 加 20 g/L 的 NaHCO3时 , 重 组 菌 的 琥 珀 酸 产量 比 野 生 菌 提 高 了 2.2 倍 。鉴 于 经 由 PCK 催 化 的 反 应 伴 有 能 量 的 生 成 , 可 能 有 利 于 琥 珀 酸 的 积 累 及 副 产 物 乙 酸 量 的 降 低 , 本 研 究 以 实 验 室 自 主 构 建 的 大 肠 杆 菌 W3110 (pfl, ldh)为 出 发 菌 株 , 利 用 -Red 同 源 重 组 系 统 10, 成功 构 建 了 pp
15、c 缺 陷 菌 株 W3110 (pfl, ldh, ppc:apra)。同 时 构 建 了 Bacillus subtilis pck 的 重 组表 达 质 粒 pTrc99a-BSpck, 该 质 粒 具 有 耐 受 高 浓 度葡 萄 糖 的 特 点 。研 究 初 步 考 察 了 过 量 表 达 PCK 对 重组 大 肠 杆 菌 W3110 (pfl, ldh) 及 W3110 (pfl, ldh, ppc:apra) 厌 氧 发 酵 产 琥 珀 酸 的 影 响 。1 材 料 和 方 法1.1 材 料1.1.1 菌 株 和 质 粒 : 大 肠 杆 菌 W3110 (pfl, ldh)为 本
16、 实 验 室 自 主 构 建 并 保 藏 , Bacillus subtilis 168 购自 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 , 本 研 究 中 构 建 的 其 他 菌 株如 表 1 所 示 。质 粒 pTrc99a、pIJ790 及 pIJ773 由 邵 蔚蓝 老 师 (南 京 师 范 大 学 )惠 赠 , 如 表 2 所 示 。表 1 本 研 究 中 构 建 的 重 组 菌 株Table 1 Recombinant strains constructed in this research名 称Name性 状CharacterYL1 W3110 (pfl, ldh, ppc:apra)
17、YL2 W3110 (pfl, ldh, )/ pTrc99a-BSpckYL3 W3110 (pfl, ldh, ppc:apra)/ pTrc99a-BSpck1.1.2 引 物 : 扩 增 阿 普 拉 霉 素 抗 性 基 因 的 引 物于 丽 等 : 过 量 表 达 Bacillus subtilis 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 激 酶 对 大 肠 杆 菌 产 琥 珀 酸 的 影 响 327http:/ 分 别 由 两 部 分 组 成 。靠 近 5端 加 下 划 线 的 序列 与 ppc 基 因 两 翼 序 列 同 源 , 靠 近 3端 未 加 下 划 线的 序 列 与 质
18、粒 pIJ773 上 阿 普 拉 霉 素 抗 性 基 因 两 侧序 列 互 补 。在 大 肠 杆 菌 染 色 体 上 ppc 基 因 同 源 重 组区 域 外 侧 , 设 计 引 物 P3、P4, 用 于 检 测 重 组 菌 株 。扩 增 Bacillus subtilis pck 基 因 的 引 物 为 P5 和 P6, 加 下 划 线 的 序 列 分 别 为 限 制 性 内 切 酶 Sac I 和 Xba I 的 酶 切 位 点 。各 引 物 的 详 细 序 列 如 表 3 所 示 。表 2 本研究中所用的质粒Table 2 Plasmids used in this research名称
19、Name大小 (bp)Size (bp)抗性Resistance抗生素浓度 (g/mL)Concentration for E. coli (g/mL)pIJ790 6084 Chloramphenicol 30pIJ773 1382 Apramycin 50pTrc99a 4176 Ampicillin 100表 3 本 研 究 中 所 用 的 引 物Table 3 Primers used in this research名 称Name序 列 (5 3)SequenceP1 ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGA
20、TCCGTCGACCP2 AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCP3 CAGGGCTATCAAACGATAAGATGP4 AAAACGAGGGTGTTAGAACAGAAGP5 CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCGP6 GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG1.1.3 主 要 试 剂 : 基 因 组 提 取 试 剂 盒 和 琼 脂 糖 凝 胶DNA 回 收 试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 质 粒 小 量 快 速 提 取
21、 试 剂 盒 为 上 海 申 能 博 彩 生 物 科 技有 限 公 司 产 品 ; DNA 片 段 回 收 试 剂 盒 、限 制 性 内 切酶 、Pyrobest DNA 聚 合 酶 和 T4 DNA 连 接 酶 为 大 连宝 生 物 有 限 公 司 产 品 ; L-阿 拉 伯 糖 购 自 Sigma 公 司 ; 酵 母 提 取 物 和 胰 蛋 白 胨 为 Oxoid 公 司 产 品 ; 其 他 试剂 为 国 产 分 析 纯 。1.1.4 培 养 基 : 有 氧 培 养 采 用 LB 培 养 基 ; 厌 氧 培养 基 为 LB 添 加 10 g/L 碱 式 碳 酸 镁 和 12 g/L 葡 萄
22、糖 。重 组 菌 培 养 时 , 阿 普 拉 霉 素 、氯 霉 素 和 氨 苄 青霉 素 在 培 养 基 中 的 工 作 浓 度 分 别 为 50、30 和100 g/mL, 诱 导 剂 IPTG 的 终 浓 度 为 0.5 mmol/L。1.2 方 法1.2.1 PCR 扩 增 : 以 质 粒 pIJ773 为 模 板 , P1、P2 为引 物 , 进 行 敲 除 用 片 段 的 扩 增 , 反 应 条 件 为 : 94C 10 min; 94C 45 s, 50C 45 s, 72C 90 s, 10 个 循 环 ; 94C 45 s, 55C 45 s, 72C 90 s, 15 个 循
23、 环 。以 平 板筛 选 出 的 阳 性 单 菌 落 为 模 板 , P3、P4 为 引 物 , 进 一步 采 用 菌 落 PCR 鉴 定 , 反 应 条 件 为 : 94C 10 min; 94C 45 s, 55C 45 s, 72C 100 s, 35 个 循 环 ; 72C 10 min。以 Bacillus subtilis 基 因 组 DNA 为 模 板 , P5、P6 为 引 物 , 进 行 pck 片 段 的 扩 增 , 反 应 条 件为 : 94C 5 min; 94C 45 s, 53C 45 s, 72C 100 s, 35 个 循 环 ; 72C 10 min。1.2.
24、2 ppc 基 因 的 敲 除 : 挑 取 W3110 (pfl, ldh)/pIJ790 的 单 菌 落 接 种 于 新 鲜 的 LB 培 养 基 (含 氯 霉素 )中 , 30C 振 荡 培 养 过 夜 后 转 接 于 50 mL 培 养 基 , 培 养 至 A600 = 0.20.3 时 , 加 入 L-阿 拉 伯 糖 诱 导 , 继续培养至 A600 = 0.50.6。将菌液置冰浴中 1520 min后 , 于 4C、8000 r/min 条 件 下 离 心 10 min, 用 10%的 无 菌 甘 油 洗 涤 菌 体 3 次 , 将 菌 体 重 悬 于 0.5 mL 甘油 中 制 成
25、 感 受 态 细 胞 。移 取 上 述 敲 除 用 PCR 产 物与 感 受 态 细 胞 混 合 , 电 击 后 加 入 1 mL 预 冷 的 LB培 养 基 , 30C 培 养 2 h, 移 取 200 L 涂 布 于 含 有 氯霉 素 和 阿 普 拉 霉 素 的 LB 平 板 上 , 30C 培 养 , 筛 选阳 性 转 化 子 。1.2.3 ppc 敲 除 菌 株 的 鉴 定 及 质 粒 pIJ790 的 消 除 : 分 别 以 得 到 的 阳 性 转 化 子 和 对 照 菌 株 的 菌 落 为 模板 , P3、P4 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 , 用 琼 脂 糖 凝 胶 电泳
26、检 测 PCR 产 物 。质 粒 pIJ790 具 有 氯 霉 素 抗 性 , 其 复 制 子 具 有 温度 敏 感 性 , 高 温 条 件 下 无 法 复 制 。将 经 过 鉴 定 的 重组 菌 株 接 种 于 LB 培 养 基 中 , 42C 振 荡 培 养 过 夜 后 , 在 37C 条 件 下 进 行 划 线 分 离 培 养 , 对 每 个 单 菌 落进 行 氯 霉 素 和 阿 普 拉 霉 素 的 抗 性 检 测 , 挑 选 对 氯 霉素 敏 感 而 对 阿 普 拉 霉 素 具 有 抗 性 的 克 隆 , 得 到 消 除质 粒 pIJ790 的 重 组 菌 株 。1.2.4 pTrc9
27、9a-BSpck 质 粒 的 构 建 : 用 试 剂 盒 提 取Bacillus subtilis 基 因 组 DNA, 以 P5、P6 为 引 物 进行 PCR 扩 增 。纯 化 后 的 pck 基 因 与 pTrc99a 质 粒 分别 经 Sac I 和 Xba I 双 酶 切 后 , 用 T4 DNA 连 接 酶 连接 并 电 转 化 W3110 (pfl, ldh)感 受 态 细 胞 , 涂 布含 有 氨 苄 青 霉 素 的 LB 平 板 , 挑 选 抗 性 克 隆 , 提 质粒 进 行 双 酶 切 鉴 定 。将 鉴 定 后 的 质 粒 电 转 化 W3110 (pfl, ldh)的
28、ppc 缺 陷 株 , 构 建 菌 株 W3110 (pfl, ldh, ppc, pTrc99a-BSpck), 将 其 命 名 为 菌 株 YL3。1.2.5 酶 活 检 测 : 将 菌 体 转 接 至 含 有 IPTG 0.5 mmol/L 的 LB 培 养 基 中 , 30C 振 荡 培 养 68 h后 , 超 声 破 碎 取 上 清 即 粗 酶 液 进 行 PPC 和 PCK 酶活 测 定 。总 蛋 白 浓 度 测 定 采 用 Bradford 法 11, 以 牛血 清 蛋 白 (BSA)为 标 准 蛋 白 。328 微 生 物 学 通 报 2010, Vol.37, No.3htt
29、p:/ 酶 活 测 定 的 反 应 体 系 见 文 献 12。通 过 测 定样 品 在 340 nm 条 件 下 的 紫 外 吸 光 值 , 计 算 反 应 体系 中 NADH 的 减 少 量 并 换 算 成 酶 的 活 性 值 。酶 活 定义 为 1 min 内 催 化 1 mol NADH 转 化 为 NAD+所 需要 的 酶 量 为 1 U。1.2.6 发 酵 条 件 及 代 谢 产 物 分 析 : 从 甘 油 冻 存 管 转接 菌 体 至 LB 培 养 基 , 37C、200 r/min 培 养 过 夜 后 , 按 10%的 接 种 量 转 接 有 氧 培 养 基 , 37C、200
30、r/min培 养 6 h 后 按 10%的 接 种 量 转 接 厌 氧 培 养 基 , 从CO2钢 瓶 中 经 0.22 m 空 气 过 滤 器 向 培 养 基 中 通CO2约 2.5 min。厌 氧 发 酵 结 束 后 , 分 别 检 测 受 体 菌 及 各 重 组 菌的 菌 体 浓 度 和 发 酵 液 中 的 琥 珀 酸 、乙 酸 含 量 等 。葡萄 糖 用 生 物 传 感 仪 (SBA40C)检 测 , 有 机 酸 用 高 效 液相 色 谱 法 (HPLC)检 测 , 色 谱 柱 为 Prevail Organic Acid, 流 动 相 为 25 mmol/L KH2PO4, pH 2
31、.0, 流 速1.0 mL/min, 紫 外 检 测 波 长 215 nm。2 结 果 与 讨 论2.1 敲 除 用 PCR 片 段 的 制 备以 质 粒 pIJ773 为 模 板 , P1、P2 为 引 物 , 扩 增 出两 端 与 ppc 基 因 上 下 游 序 列 同 源 , 中 间 为 阿 普 拉 霉素 抗 性 基 因 的 DNA 片 段 , 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定约 为 1500 bp, 与 理 论 值 一 致 , 如 图 2 所 示 。2.2 ppc 基 因 缺 陷 株 的 鉴 定分 别 以 从 含 有 氯 霉 素 和 阿 普 拉 霉 素 的 平 板 上 筛选 到
32、的 转 化 子 和 对 照 菌 株 的 菌 落 为 模 板 , P3、P4 为引 物 , 进 行 PCR 扩 增 , 对 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳检 测 。电 击 入 感 受 态 细 胞 的 线 性 DNA 片 段 长 度 为1465 bp, 而 ppc 基 因 的 长 度 为 2766 bp, 同 源 重 组后 的 片 段 长 度 约 为 1500 bp。如 图 3 所 示 , 阳 性 转 化子 PCR 产 物 约 为 1500 bp, 而 假 阳 性 转 化 子 及 对 照菌 株 PCR 产 物 约 为 2700 bp, 与 预 计 的 理 论 值 相符 。说 明 重 组
33、 菌 染 色 体 上 的 ppc 基 因 已 经 被 阿 普 拉霉 素 抗 性 基 因 所 取 代 , ppc 基 因 被 成 功 敲 除 。图 2 质 粒 pIJ773 的 阿 普 拉 霉 素 抗 性 基 因 PCR 扩 增Fig. 2 PCR amplification of apramycin resistance gene in plasmid pIJ773注 : M: DNA 分 子 量 标 准 ; 1: 目 的 基 因 PCR 产 物 (1465 bp).Note: M: DNA marker; 1: PCR product of the target gene (1465 bp)
34、.图 3 ppc 基 因 缺 陷 株 的 PCR 鉴 定Fig. 3 PCR identification of ppc mutants注 : M: DNA 分 子 量 标 准 ; 1、2、3 分 别 为 对 照 菌 株 、阳 性 重 组 菌株 和 假 阳 性 重 组 菌 株 的 PCR 产 物 (大 小 分 别 为 2766 bp、1552 bp、2766 bp).Note: M: DNA marker; 1: PCR product of ppc gene in the host strain (2766 bp); 2: PCR product of ppc gene in the mut
35、ant strain (1552 bp); 3: PCR product of ppc gene in the false recombinant strain (2766 bp).2.3 Bacillus subtilis pck 基 因 的 克 隆图 4 为 从 Bacillus subtilis 基 因 组 上 扩 增 出 的pck 片 段 , 大 小 约 为 1600 bp, 与 理 论 值 相 近 。连 接至 pTrc99a 后 的 重 组 质 粒 鉴 定 如 图 5 所 示 , 双 酶 切鉴 定 的 结 果 与 预 期 一 致 。目 的 基 因 已 成 功 插 入 至pTrc99a
36、 中 。2.4 各 菌 株 的 PPC 和 PCK 酶 活 测 定对 出 发 菌 株 和 构 建 的 各 重 组 菌 株 进 行 粗 酶 液 的相 应 酶 活 测 定 , 计 算 出 粗 酶 液 的 比 酶 活 , 结 果 如 表4 所 示 。由 表 4 可 以 看 出 , 出 发 菌 株 的 PPC 活 力 较 高 , 而 PCK 活 力 很 低 , 说 明 在 正 常 情 况 下 主 要 由 PPC催图 4 Bacillus subtilis pck 基 因 PCR 扩 增Fig. 4 PCR amplification of Bacillus subtilis pck gene注 : M
37、: DNA 分 子 量 标 准 ; 1、2: Bacillus subtilis pck 基 因 (1650 于 丽 等 : 过 量 表 达 Bacillus subtilis 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 激 酶 对 大 肠 杆 菌 产 琥 珀 酸 的 影 响 329http:/ M: DNA marker; 1,2: PCR product of Bacillus subtilis pck gene (1650 bp).图 5 质 粒 pTrc99a-BSpck 的 双 酶 切 鉴 定Fig. 5 Identification of pTrc99a-BSpck by restri
38、ction endonuclease digestion注 : M: DNA 分 子 量 标 准 ; 1、2: 重 组 质 粒 pTrc99a-BSpck Sac I和 Xba I 双 酶 切 产 物 (大 小 为 4159 bp 和 1647 bp).Note: M: DNA marker; 1,2: Products of pTrc99a-BSpck digested by Sac I and Xba I (4159 bp and 1647 bp).表 4 各 菌 株 的 PPC、 PCK 酶 活 比 较Table 4 Activity of the enzymes PPC, PCK in
39、 crude extracts of the recombinants菌 株StrainsPPC 酶 活PPC activity (U/mg)PCK 酶 活PCK activity (U/mg)W3110 (pfl, ldh) 0.29 0.032YL2 0.16 0.63YL3 0 0.56化 PEP 生 成 OAA 的 反 应 。过 量 表 达 Bacillus subtilis pck 后 , PCK 活 力 由 0.032 U/mg 升 至 0.63 U/mg, 酶 活 提 高 了 将 近 20 倍 , 而 PPC 活 力 与 出 发菌 株 相 比 则 稍 有 下 降 。敲 除 ppc
40、 后 过 量 表 达Bacillus subtilis pck, PCK 活 力 也 有 很 大 程 度 的 提 高 , 为 0.56 U/mg。2.5 各 菌 株 的 厌 氧 发 酵 结 果 分 析以 出 发 菌 株 作 为 对 照 , 考 察 各 重 组 菌 株 厌 氧 发酵 产 琥 珀 酸 的 情 况 。检 测 了 厌 氧 发 酵 结 束 时 发 酵 液的 菌 体 细 胞 干 重 (DCW)、pH、葡 萄 糖 含 量 及 琥 珀 酸和 乙 酸 的 含 量 , 结 果 如 表 5 所 示 。出 发 菌 株 因 为 缺 失 了 pfl 和 ldh 基 因 , 造 成 丙 酮酸 的 积 累 ,
41、 使 得 菌 株 代 谢 葡 萄 糖 的 速 度 非 常 缓 慢 。过 量 表 达 Bacillus subtilis pck 在 一 定 程 度 上 恢 复 了出 发 菌 株 代 谢 葡 萄 糖 的 能 力 , 72 h 内 可 消 耗 8.25 g/L 葡 萄 糖 产 2.21 g/L 琥 珀 酸 , 产 酸 能 力 为 出 发 菌株 的 6 倍 , 同 时 也 恢 复 了 细 胞 的 生 长 , DCW 较 出 发菌 株 提 高 了 约 1.5 倍 。敲 除 ppc 后 过 量 表 达 Bacillus subtilis pck, 菌 株 代 谢 葡 萄 糖 的 能 力 进 一 步 提
42、高 , 72 h 内 消 耗 10.5 g/L 葡 萄 糖 产 5.52 g/L 琥 珀 酸 , 产 酸能 力 比 出 发 菌 株 提 高 了 约 15 倍 , 琥 珀 酸 对 葡 萄 糖的 质 量 收 率 达 54%, 且 副 产 物 乙 酸 的 量 极 低 。说 明经 由 PCK 催 化 PEP 到 OAA 的 反 应 对 菌 株 的 生 长和 产 酸 更 为 有 利 。3 结 论本 研 究 以 实 验 室 自 主 构 建 的 大 肠 杆 菌 W3110 (pfl, ldh)为 出 发 菌 株 , 利 用 -Red 同 源 重 组 系 统敲 除 了 ppc 基 因 , 并 过 量 表 达
43、了 Bacillus subtilis pck基 因 , 构 建 了 一 系 列 重 组 菌 株 , 初 步 考 察 了 过 量 表达 pck 对 大 肠 杆 菌 厌 氧 发 酵 产 琥 珀 酸 的 影 响 。结 果表 明 : 过 量 表 达 pck 可 以 部 分 恢 复 对 照 菌 株 厌 氧 条件 下 代 谢 葡 萄 糖 的 能 力 , 其 中 又 以 ppc 缺 陷 株 最 为明 显 , 其 耗 糖 能 力 和 产 酸 能 力 分 别 为 出 发 菌 株 的4.2表 5 各 菌 株 的 厌 氧 发 酵 结 果Table 5 Anaerobic fermentation results
44、of the recombinants菌 株Strains初 糖Initial glucose(g/L)时 间Time(h)残 糖Residual glucose(g/L)DCW(g/L) pH琥 珀 酸Succinic acid(g/L)乙 酸Acetic acid(g/L)W3110 (pfl, ldh) 11.75 72 9.25 0.712 7.52 0.36 0.37YL2 12.00 72 3.75 1.730 7.09 2.21 0.52YL3 11.25 72 0.75 1.780 6.98 5.52 0.07和 15.3 倍 , 且 副 产 物 乙 酸 的 量 很 低 。鉴
45、于 PCK 对 底 物 HCO3的 亲 和 能 力 远 远 低 于PPC, 因 此 通 过 进 一 步 考 察 细 胞 内 碳 酸 氢 盐 的 浓 度 , PCK 对 碳 酸 氢 盐 的 亲 和 力 等 因 素 , 可 进 一 步 提 高330 微 生 物 学 通 报 2010, Vol.37, No.3http:/ 重 组 菌 株 的 生 长 和 产 酸 性 能 。此 研 究 为 利 用 基 因工 程 手 段 进 一 步 改 造 大 肠 杆 菌 生 产 琥 珀 酸 奠 定 了基 础 。参 考 文 献1 王 大 勋 , 马 铁 宁 . 从 深 度 氧 化 石 蜡 中 提 取 琥 珀 酸 . 化
46、 学工 程 师 , 2003, 96(3): 1516. 2 王 庆 昭 , 吴 巍 , 赵 学 明 . 生 物 转 化 法 制 取 琥 珀 酸 及 其 衍生 物 的 前 景 分 析 . 化 工 进 展 , 2004, 23(7): 794798.3 Lee PC, Lee SY, Hong SH, et al. Biological conversion of wood hydrolysate to succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens. Biotechnology Letters, 2003, 25(2): 11111
47、4.4 McKinlay JB, Zeikus JG, Vieille C. Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11): 66516656.5 Lee JW, Lee SY, Song H, et al. The proteome of Mannheimia succiniciproducens, a capnophilic
48、 rumen bacterium. Proteomics, 2006, 6(12): 35503556.6 Clark DP. The fermentation pathways of Escherichia coli. FEMS Microbiology Reviews, 1989, 63(3): 223234.7 姜 岷 , 马 江 锋 , 陈 可 泉 , 等 . 重 组 大 肠 杆 菌 产 琥 珀 酸 研究 进 展 . 微 生 物 学 通 报 , 2009, 36(1): 120124.8 Millard CS, Chao YP, Liao JC, et al. Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli. Appiled and Environmental Microbiology, 1996, 62(5): 18081810.9 Kwon, Deok Y, Lee SY, et
