1、信阳师范学院学报：自然科学版 第22卷第2期2009年4月 Journal ofXinyang Normal University Natural Science Edition Vo122 No2 Apr2009 DOI：103969jissn1003-0972200902019 铁皮石斛内生真菌的分离与鉴定 陈玉栋 ，李文锦，雷 玲，刘改艳，卢东升 (信阳师范学院生命科学学院，河南信阳4640O0) 摘要：从铁皮石斛(Dendrobium candidum)的根、茎、叶中分离获得内生真茼共30株，经显微形态观察 将其中20株鉴定为3个目、4个科、9个属结果表明，铁皮石斛不同部位内生真菌的数
2、量、分布和种群存有差 异 关键词：铁皮石斛；内生真茵；分离；鉴定 中图分类号：Q936 文献标志码：A 文章编号：1003-0972(2009)02-0236-03 Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Dendrobium candidum CHEN Yudong，LI Wen-jin，LEI Ling,LIU Gai-yan，LU Dong-sheng (Coege ofLife Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang464000，China) Abstract：Thirty
3、 strains of endophytic fungi were isolated from the root，stem and leaf ofDendrobium candidum， and twenty strains of them were morphologically identified belong to nine genera，four families and three ordersIt has shown that quantity，species，and distributing of the endophic funsi varied in different p
4、arts of Dendrobium candi dur,r Key words：Dendrobium candum；endophytic fungi；isolation；identification 0 引言 内生真菌(endophytic funsi)是指那些在其生 活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组 织没有引起明显病害的菌，它包括那些在其生活史 中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有 伤害的潜伏性病原菌和菌根菌内生真菌因其 独特的生活环境，与宿主关系密切它可增强宿主 的生长，并能提高宿主的抗逆性及病毒的抵抗能 力 J此外，植物内生真菌还能够产生结构新颖， 功能特殊的次生代
5、谢产物，是新化合物、新药物的 潜在资源 因而，研究植物内生真菌与其宿主 的相互关系具有重要意义 石斛(Dendrobium)是兰科石斛属多年生附生 草本植物，主要分布于西南和江南各省，是经济价 值和医用价值颇高的名贵中药铁皮石斛(Den- drobium candidum)是石斛类的极品，具有抗肿瘤， 抗衰老，增强免疫力等多种功能 由于石斛自然 分布较少，生长缓慢，繁殖率低以及过度采伐，其野 生资源已遭严重破坏，被列为濒危保护的中药品 种 近年来，对石斛内生真菌的分离主要集中于 用石斛的根来分离与其共生的菌根真菌，一般是作 为兰科植物之一来进行的 ，专门系统地进行石 斛内生真菌分离鉴定的很少
6、本实验从铁皮石 斛的根、茎、叶中分离出内生真菌并对其种类和分 布进行了初步研究，旨在为提高铁皮石斛的人工栽 培技术、试管苗成活率和药物开发提供理论依据 1材料和方法 11实验材料 3年以上生铁皮石斛，系组培苗栽培而成，长 势一直良好，无其他病虫害，其培养土壤为珍珠岩 与腐殖土按1：1的比例混合成 12分离培养基 分离培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)， 每升含氯霉素60 mg，用于抑制细菌的生长 日稿日期：2008439-28；修订日期：20081106：通讯联系人。E-mail：ydchen999yahoocornca 基金项目：河南省科技计划项目(082102130029)；河南省高等学
7、校青年骨干教师资助计划项目(教高2007335) 作者简介：陈玉栋(1971)，男，河南淮滨人，副教授，博士，主要从事内生真菌的分离与鉴定 236 陈玉栋，等：铁皮石斛内生真菌的分离与鉴定 13内生真菌的分离 131样品消毒处理 取铁皮石斛植株用自来水冲洗干净、去腐叶、 晾干水分后，转到无菌操作台上进行下面处理：根 和茎剪成约3 cm的小段，叶片剪成约3 cm3 cm 小片，然后用下述方法进行表面消毒 根和茎：75酒精处理2 min 无菌水漂洗3 次-+1次氯酸钠处理10 min一无菌水漂洗3次_+ 75酒精处理1 min 无菌水漂洗3次 叶：75酒精处理1 min一无菌水漂洗3次 1次氯酸钠
8、处理8 min_+无菌水漂洗3次一75 酒精处理05 min一无菌水漂洗3次 132分离培养 在无菌状态下取经过处理消毒的铁皮石斛根、 茎、叶不同部位，切成02 cm02 cm片段(厚度 尽量切薄)种植于培养基内，置(28 4-1)条件 下静止培养培养510 d后，培养基中可见有菌 落形成，挑取植物组织周围的菌落转接人PDA斜 面中纯化纯化的菌株在PDA斜面4下保存， 备用 14分类鉴定 采用插片培养方法，分离获得的铁皮石斛内生 真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定分类检 索参照文献1214 2结果与讨论 21 铁皮石斛内生真菌种属 从根茎叶中分离出内生真菌共30株，产孢的 20种经鉴定为3个
9、目、4个科、9个属(见表1)有 10株未鉴定 表1铁皮石斛内生真菌种群组成 Tab1 The composing of endophytic fungi in Dendrobium candidum 铁皮石斛的内生真菌中以镰刀菌属(Fusarium sp)为优势种群，占总数的233，其次是曲霉属 (Aspergillus sp)占10，轮枝霉属(Verticillium sp)占10 22铁皮石斛内生真菌在植物器官中的分布 2O株内生真菌的分布各有特点根部和茎部 在数量和种属上占有优势根部有l8株(占总菌 数的6O00)，3个属；茎部11株(3637)，6 个属；叶部只分布了1个属(333)(
10、见表2) 在根中，镰刀菌属(Fusarium sp)是其中的优 势种群，占根内部3889，同时也是整株铁皮石 斛分离得到菌株最多的属在茎部分离得到的内 生真菌优势种类是轮枝霉属(Verticillium sp)，占 到茎部内生真菌的2727叶中只分离出青霉属 (Penicillium sp)1株 表2铁皮石斛内生真菌的数量与种类分布 Tab2 The distributing in number and species of endophytic fungi in Dendrobium candidum 从表2中可以看出，铁皮石斛根茎叶中都分离 出内生真菌，说明内生真菌普遍存在于这些器官 中，
11、但内生真菌在植物器官中的分布差异较大，根 和茎中分离得到的内生真菌种类和数量较多，而叶 中只得到1种根、茎、叶中的一些内生真菌种类 明显不同，说明铁皮石斛的内生真菌种类具有一定 的组织专一性这表明了铁皮石斛内生真菌的数 量和种群多样性特点 3 结论 分离并鉴定出的20株内生真菌，从分类上看， 分属于3个目，4个科，9个属；从内生真菌存在部 位看，铁皮石斛根茎叶中均有内生真菌，但内生真 237 第22卷第2期 信阳师范学院学报：自然科学版 2009年4月 菌的种类和数量有明显差别这些特点与生态系 统中物种多样性是一致的所分离的内生真菌中， 镰刀菌属(Fusarium sp)分离频率最高，是铁皮石
12、 斛内生真菌中的优势种群 据研究，已鉴定的石斛内生真菌主要分属担子 菌亚门(Basidiomycotina sp)和半知菌亚门(Deu teromycotina sp)11但本实验只分离出半知菌 亚门(Deuteromycotina sp)的镰刀菌属(Fusarium sp)、曲霉属(Aspergillus sp)、毛壳菌属(Chaeto mittm sp)、枝孢霉属(Cladosporium sp)、青霉属 (Penicillium sp)、轮枝霉属(Verticillium sp)、链 格孢属(Alternaria sp)、拟茎点霉属(Phomopsis sp)、木霉属(Trichoder
13、ma sp)，而未发现担子菌 (Basidiomycotina)亚门的菌株，这可能与信阳所处 的地理位置和生态条件有关有研究结果表明，同 种植物在不同的地方，可能有不同的内生真菌 另外也有可能是因为以下几种因素的一种或几种： 本次实验用的植株量较少，所采用的植株只是由组 培苗在室内环境条件下培养，与野外或大田环境存 在很大差异；铁皮石斛内生真菌不含半知菌亚门 (Deuteromycotina)的种属或很少；本实验中剩余10 株有待鉴定的菌株可能会存在半知亚门的菌株 具体是哪些原因，尚有待于进一步深入研究但由 此可以推测，随着调查范围的扩大，石斛品种的增 多，将会有更多的内生真菌被发现 参考文献
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