1、猪胚胎移植关键点讨论摘要：由于猪的生长周期短，商品化程度高，传统的生产繁殖方式已经不能满足需要，胚胎移植技术应运而生。本文论述了猪的胚胎移植各个关键控制点和目前所应用的技术，以及在 生产实践中的应用。关键词 胚胎移植 技术 冷冻1890 年 Heape 在英国剑桥大学首次报道获得兔子胚胎移植成功以来，胚胎移植技术已有 100 多年的研究历史。20 世纪 30 年代以来，胚胎移植的研究越来越多，对各种家畜均获成功，主要有绵羊（1934） 、山羊（1949） 、猪（1951） 、牛（1951） 、马（1974） 。1975 年 1 月在美国科罗拉多州召开了第一届国际胚胎移植学会成立大会，标志着胚胎
2、移植技术进入了更高的发展阶段。,1976 年牛的非手术移植技术推广，1977 年开始商业化应用，13 个国家成立了数百家商业化胚胎移植公司。仅北美洲 ,1978 年移植后妊娠的牛近 1 万例，目前仅美国每年通过胚胎移植技术而妊娠的牛达 30 万 1。而猪的胚胎移植，一方面由于猪是多胎动物，胚胎移植被陷入应用范围较窄的误区；另一方面是由于配套的非手术取卵和移植及胚胎冻存很困难， 因此至今未能像牛、羊那样被广泛应用。综合国内外目前的已有技术和水平，猪胚胎移植技术的应用已处于水到渠成的阶段， 并且能够给种猪的生产经营者带来可观的经济效益。从妊娠的母猪子宫内取出受精卵， 将其移植到发情周期相同的其它母
3、猪体内， 并使其妊娠、 着床、分娩的过程就是猪的胚胎移植技术。猪的胚胎移植 1951 年在世界上首次获得成功。出于猪的生殖系统构造复杂及猪受精卵对低温抵抗力较弱等原因， 猪胚胎移植技术目前还未得到普及。但是，近年来，作为猪群净化和繁殖改良的手段，已被世界养猪界所关 2。1 前期准备在初产母猪的正常发情周期的第 15 天或 16 天，用 10001500IU 的孕马血清促性腺激素皮下或肌肉注射， 平均可排卵 20-30 个。或者孕马血清促性腺激素与人绒毛膜促性腺激素配合使用， 即在性周期第 15 天注射孕马血清促性腺激素 1000IU 后再注射人绒毛膜促性腺激素 500IU 可有效增加排卵数。经
4、超排处理的初产母猪于给予孕马血清促性腺激素后 4 天开始发情， 比正常发情时间要早 1 天。初情期前的青年母猪（5-6）月龄同样可以进行超数排卵处理。一般用 2502000IU 的孕马血清促性腺激素肌肉注射，48 小时后再用 500IU 人绒毛膜促性腺激素，24 小时后进行人工授精，平均 22 个排卵数获得 13 个受精卵。青年母猪对孕马血清促性腺激素反应有明显的季节性差异， 其它季节要使用春季用量的 2 倍。青年母猪的超数排卵效果比经产母猪好， 这可能与青年母猪的排卵数相对较少有关。在进行胚胎移植时， ， 供体与受体母畜的生殖周期，一般应力求同期化。否则，移植的胚胎因生理环境不适而被排除掉。
5、 在进行猪胚胎移植时， 受体猪较供体猪发情慢 1 天或 2 天为最好。 近年来， 许多人工合成内分泌激素开发成功，由单独应用孕酮发展到孕酮与雌激素联合应用，对猪施行超数排卵， 其主要目的是确保供胚母猪能够多排卵， 产生更多的胚胎供移植使用 【2】 。2 胚胎的采集当确认供卵猪发情之后，使其自然交配或人工授精。从发情开始 47 天内采取受精卵。目前，胚胎采集及移植技术，包括外科手术，非外科，内窥镜3 种方法。 2.1 外科手术法早在 1982 年就有人总结了手术法的经验，并且研究了影响其结果的各种因子。手术法和非手术法两者主要的差别是，前者需要对供体猪进行麻醉，在其腹部中线的一定区域切开一个切口
6、，暴露出生殖道，在输卵管或者子宫角收集胚胎。对受体猪也需要麻醉和手术，并在与供体猪的生殖道的相同部位植入胚胎。实施手术时，青年母猪比经产母猪更耐受麻醉，也更容易操作。收集胚胎时，根据胚胎发育的阶段，使用少量的胚胎冲洗液，通过导管将胚胎收集在检胚皿中，经过形态学鉴定，将可用的胚胎移植给受体。据 Hazele 目”和 Kemp等(1997)的报告，应用手术法受体母猪的平均妊娠率为 75一 100，窝产仔数为 6.410.8 头。据魏庆信等(2003)报告，供体母猪在发情周期第 1518 d使用 PMsG 10IU/kg 处理，72 h 后用 HCC l0IU/g 处理，应用手术法从输卵管回收胚胎，
7、湖北白猪、北京花猪可获得 23 枚胚胎，杜洛克母猪 17 枚胚胎，太湖猪 32 枚胚胎。受体母猪的妊娠率为 8083，窝产仔 7.8 头。据王前和牛树理等(2003)在江西的试验，供体为第 4 胎的长白母猪，自然发情后 56 d 后手术，在子宫角中部平均回收 24 枚(2228 枚)胚胎，移植 8 头杂种母猪，妊娠率为 87.9，平均窝产仔 l0.8 头(9.5 一 13 头)，供体母猪在 22 d 后又重新发情配种，平均产仔 10.5 头，并没有影响本身的繁殖。我国山东省也报告了手术法移植成功的消息。外科手术一个重要环节就是麻醉，有一些常用的方法需要了解。当天早晨需要禁食，保持空腹状态。选择
8、提早 115 d 发情的经产母猪进行麻 3。 一戊巴比妥钠水溶液麻醉：保定绳保定代孕母猪，使用静脉输液器和 50 mL 注射器耳缘静脉注射戊巴比妥钠，等母猪自行卧倒后，抬上保定架，用保定绳保定四肢；耳缘静脉滴注戊巴比妥钠保持麻醉。二硫喷妥钠水溶液麻醉：保定绳保定代孕母猪，使用静脉输液器和 50 mL 注射器耳缘静脉注射硫喷妥钠，等母猪自行卧倒后，抬上保定架，用保定绳保定四肢；观察母猪麻醉状态，耳缘静脉滴注硫喷妥钠保持麻 4。三硫喷妥钠戊巴比妥钠混合麻醉：保定绳保定代孕母猪，使用静脉输液器和 50 mL 注射器耳缘静脉注射硫喷妥钠，等母猪自行卧倒后，抬上保定架，用保定绳保定四肢；观察母猪麻醉状态
9、，耳缘静脉滴注戊巴比妥钠保持麻醉。四酒精麻醉：由于其中一次试验中戊巴比妥钠水溶液麻醉剂的损失，在保定架保定后，再使用酒精麻醉，使用胃管向胃中灌注酒精(45含量)保持麻醉。麻醉后，猪体进入安静平稳状态后进行外科手术移植克隆胚胎。2.2 非手术法非手术法的研究，已经有 32 年的历史。该法是通过子宫颈在子宫内收集胚胎。有人在 1970 年，从配种后第 35 d 屠宰的供体母猪体内收集胚胎，通过导管转移到受体母猪的子宫体内，17 头受体只有 1 头妊娠。在屠宰后发现，有3 个发育中的胚胎和 4 个胚胎残体。他们得出了结论：非发情期的青年母猪的子宫颈是紧闭的和难于进入的，但只要通过了子宫颈，在子宫内和
10、子宫角植入胚胎的是容易 5。此后的试验，还没有得到理想的结果，主要的原因是植入胚胎的部位问题。胚胎在供体内的部位与植入受体内的部位是否相似，是能否妊娠的重要因子。据报道，也有使用全麻的方法进行非手术移植。为了把子宫颈拉直，促进胚胎通过重力转移，将受体母猪的后腿与臀部升起与水平面呈 45，固定在手术床上。工作人员使用螺旋状的人工授精管插入子宫体，然后使用特殊设计的不锈钢子宫颈开塞器，撑开子宫颈口，以内置的柔性细管(长 170 cm，外径 3.5mm，内径 2mm)将胚胎转移人子宫角。试验分为 2 组进行。第 l 组将胚胎植入子宫角中部，输入含有 1020 mL 培养液。另 l 组使用常规的人工授
11、精方法，给予小剂量镇静剂或不使用镇静剂。二组都使用导管与三通管相连，进入子宫后用 10 一 20mL 培养液，再用 15mL 空气排空导管内的液体，也有使用少量液体多次冲洗，总量 50mL，最后用 l0 mL 空气排空液体。对经产母猪使用镇静剂，应用柔性导管通过子宫颈插入导管，在子宫角中部植入胚胎。此法获得受体母猪的妊娠率为 33。经过多次改良，最近(2004)取得了平均妊娠率为59。多数报告妊娠率在 19一 64，窝产仔 3.110.9 头。虽然各研究者使用的方法不同，但应用镇静剂的受体母猪平均妊娠率达 60。使用特殊设计的导管，比其它方法能使胚胎植入到子宫角，窝产仔 611 头。植入胚胎时
12、，输入少量的胚胎培养液，应用柔性导管是非常重要的。因为母猪在妊娠早期，子宫液分泌很少。输入液体量大时，植入的胚胎会随液体流入子宫颈管，造成胚胎的损失或死亡。在农场的条件下和猪的人工授精一样，使用简单的设备和花最少的时间，实施非手术法是可行的。因此使用腹腔镜法而不使用手术实行胚胎移植也是一种可行的方法，但仍需要设备。据介绍，在非麻醉的条件下使用柔性导管通过子宫颈，对经产母猪移植非常容易，但对青年母猪由于子宫颈狭窄和闭锁，比较困难。但是所有的方法，特别是非手术法更需要训练有素的人员。2.3 内窥镜法内窥镜法是一种精细的外科手术，切口很小，只需在腹部切开 1cm 左右的23 个小口，将腹腔镜插入，进
13、行收集和植入胚胎。这种方法仍需要麻醉和类似于常规手术的程序。腹腔镜法移植平均妊娠率为 14一 46，窝产仔 8 头左右。据 Bmssow 等的报告，最近妊娠率已提高到 90。这种损伤性很小的方法，已在国外个别农场中应用。3 胚胎移植含有胚胎的冲洗液于立体显微镜下找出胚胎。经检查形态学正常的胚胎可用于移植， 移植胚胎时， 只需将胚胎植入一侧子宫即可，因为猪胚胎在子宫内会迁移，最后在两侧子宫均匀分布（Dziuk 等 1964）一般植入受精卵的数目以 10-20 个为宜。外科术式移植胚胎， 可采用腹中线切口法，也可用我国民间阉割猪手术法， 后者效果较好， 且不需缝合切 【3】 。移植胚胎的部位取决于
14、胚胎发育阶段。子宫植胚时，可直接在输卵管峡部距子宫顶端附近穿刺，然后将吸管缓慢插入子宫腔。 输卵管植胚时， 从输卵管伞部插进胚胎吸管约5cm。3-7 日龄猪胚胎移植到同期化受体内，平均受孕率达 85%， 移植胚存活率高达 70%。目前还无数据说明，影响非手术移植的因素和如影响的。日龄和胚胎发育的阶段，同期化率和胚胎收集的方等，这些都需要通过实验测定。另外青年母猪和经产猪的供体与受体同期化的方法，胚胎发育阶段，冲洗培养胚胎液的成分、时间和温度等都需要深入研究。有报告指出，胚胎的培养在 3 d 以上时，将造成质量降和妊娠率降低。 Kemp 等(2000)报告，试验组胚胎存 3d 后，移植母猪的妊娠
15、率只有 9一 53，而对照用鲜胚移植的妊娠率为 7080。由于远距离移的需要，使用保存了 3034 h 的胚胎，移植后妊娠为 47，窝产仔数为 5.6 头。尽量缩短胚胎在体外保的时间，可提高受体母猪的妊娠 6。当前，非手术法胚胎移植，对种猪场似乎可以应用。但是该方法一方需要在实践中检验和优化，补充各方面有关成功的息。另一方面必须建立卫生规程，以预防感染因子的传 7。对于猪胚胎移植也要建立类似人类和牛胚胎移植的安全规范是一条重要的经验。4 胚胎的体外培养和体内胚比较，体外生产的胚胎染色体倍型的异常率高出许多，rRNA 基因的活性明显不同许多蛋白因子基因的表达情况存在差异,冷冻保存的效果也较差,体
16、外培养系统的缺陷也是导致胚胎吸收,死亡,流产,死胎或出生后死亡,以及胎儿过大综合症的一个重要方面.经过几十年的研究,人们对胚胎早期发育对环境的需求及自身的代谢特征的认识不断深入根据不同发育阶段营养和 A 代谢特征的不同,一些序列培养系统被设计建立起 8目前使用的培养液中,共同的特点是不含葡萄糖,代之以乳酸或丙酮酸为能量供应物. 小鼠，仓鼠，绵羊，牛及人的早期胚胎在致密化之前对葡萄糖的利用能力很有限，而主要以丙酮酸乳酸和氨基酸为能量代谢的底物. 直至密化期以后，胚胎对葡萄糖的摄入和利用都在增加.。在不含氨基酸的条件培养液中，葡萄糖甚至会抑制胚胎的早期卵裂。葡萄糖对早期胚胎发育的抑制作用与它在磷酸
17、盐存在的情况下可以诱导细胞呼吸的抑制有关，呼吸的抑制会导致 ATP 产生效率的下 9.非必需氨基酸和谷氨酰胺对胚胎发育的保护和促进作用表现在几个方面! 首先它能调节胚胎的能量代谢! 非必需氨基酸和谷氨酰胺可通过抑制糖分解活性来降低葡萄糖对早期胚胎发育的有害作用,它们还能调节渗透压, 保持细胞内的生理稳定.非必需氨基酸和谷氨酰胺在致密化前期胚胎发育的作用有协同性.谷氨酰胺单独添加不会对细胞发育产生促进作用.非必需氨基酸不配合使用谷氨酰胺也会降低它的作用效果.在这个阶段,谷氨酰胺的主要作用是维持渗透压的平衡,谷氨酰胺主要被用来作为能量供应物,维持渗透平衡的作用降低，针对上述特点，在胚胎培养的过程中
18、在培养液中加入非必需氨基酸和谷氨酰 10， 然后再加入全部 20 种氨基酸，不仅能提高胚胎稳定发育的效率，而且胚胎发育的质量也高，囊胚中滋养层及内细胞团中细胞的数量都能显著增加。血清是胚胎培养中添加的主要蛋白质源物质，它在保持细胞的存活，促进生长，维持细胞 ，及渗透压的稳定，增加细胞弹性及膜的完整性等方面都发挥着重要作用。 但血清组成复杂，包括生长因子，激素，维生素，矿物质，细胞因子以及其他一些还未确定的物 11。胚胎代谢过程产生的反应氧，能改变细胞内的一些分子，对胚胎的发育有阻滞或延迟效果。自然情况下，胚胎细胞有多种保护氧化作用的机制，卵泡或生殖道内有次牛磺酸，牛磺酸以及维生素等物质，这些非
19、酶性物质对胚胎发挥外部抗氧化效应细胞内的抗氧化作用主要通过一些抗氧化酶来实现的。卵母细胞及胚胎细胞内都有过氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，谷氨酰半胱氨酸合成酶等物质的转录本的贮存，这些物质对胚胎的正常发育是不可缺少 12。5 胚胎的冷冻保存51 原理冷冻程序的原理是保持各种冷冻损害因素和低浓度冷冻保护剂之间的平衡，使渗透压损害、冷冻剂毒害降至最低程度)，控制冰晶形成，在胚胎内外形成非冰固体。在解冻期间用蔗糖去除冷冻保护剂，保护胚胎免受渗透压休克(Nagashima 等，1992，1994)。先将胚胎在一定浓度的冷冻保护剂中平衡一段时间，然后在一 7。C 进行人工强制植冰，植冰后胚胎外冰晶开始
20、形成，胚胎内水分也不断渗透到细胞外，随着这个过程在缓慢的降温过程中不断进行，胚胎内水分降低到一定程度，从而最大限度地限制了胚胎内冰晶的形成。慢速冷冻遵循的原则是最大限度地保持影响冷冻效果的各种因素之间的平衡，从而使渗透性应激、冷冻剂毒性、冰晶的物理损伤降至最 13。在解冻过程中，往往都要添加高浓度的蔗糖，其目的主要是防止在解冻过程中细胞外水分快速渗透到胚胎内造成的渗透性休克。5.2 胎冷冻保存的影响因素5.2.1 温度猪胚胎对低温非常敏感，低于 15。C 时胚胎的存活率就显著降低。一般认为 15。C 是胚胎能够耐受的临界温度。对猪桑椹胚在低温下的存活率的研究表明，在 15。C 时存活率约为 9
21、0，当温度降封 14。C 时，下降到 10以下。猪桑椹胚在温度低于 13。C 的条件下停留 10 min，胚胎就会丧失生存性。猪胚胎在 13。C 以下保存时，细胞膜的稳定性发生改变，膜松散扩张，通透性发生改14。猪胚胎细胞内含有大量的脂肪滴颗粒，这些脂肪颗粒的存在影响了细胞膜的功能。其可能的原因是脂肪中存在着引起胞质内亚细胞器聚合而发生损伤的成分。在冷冻时去除细胞质内的脂肪滴颗粒，或在保护液中添加某些细胞膜的蛋白，可减轻低温时膜的损伤，由此可见低温导致胚胎死亡的本质是质膜损伤。同时人们还发现，猪胚胎引起损伤的原因可能是原生质或内膜中相位的分 15。5.2.2 胚胎的发育阶段不同发育阶段的猪胚胎
22、对低温的耐受性存在很大的差异，而这种冷冻耐受性的差异与胚胎内较高的脂肪含量有关，胞质内脂肪滴含量的多少会影响胚胎的存活率。猪胚胎 18 细胞期胚胎细胞质内嗜苏丹脂肪滴含量较丰富，且为大小不等的脂肪颗粒。随着胚胎的发育，当发育到 16 细胞时，细胞器之间分布有很少的脂肪滴。胚胎发育到孵出囊胚时其脂肪滴进一步减 16。5.2.3 胚胎细胞质内脂肪滴的影响胚胎细胞质内脂肪滴的存在，对于降温和解冻期间胚胎的存活率有直接的影响。去除胚胎细胞质内的脂肪滴，可起到两个方面的作用：(1)引起细胞膜中脂肪成分的变化，从而减轻降温期间膜相位分离和膜损伤程度；(2)引起细胞器中亚细胞定位过程中严重破坏的细胞质成分减
23、少。6 结语胚胎移植的重要效益之一是在全球以胚胎运输代替活猪运输。它有最低的成本和最小的疾病风险。目前已经有数例报道，表明了该技术实际应用的可行性。使用损伤性最小的内窥镜法收集胚胎，并以非手术法通过子宫颈将胚胎植入到受体的方法将极大地提高胚胎移植的效率和效益，实现全世界性的以胚胎运输代替活猪运输，可改善猪群的健康状况。我国的猪胚胎移植没有受到应有的重视，今后应该介绍国外的研究成果，改变我们的思维方式。实现养猪业现代化，繁殖技术的创新是不可缺乏的。我们应该在国际先进水平线 I 二起步，政府和企业加大投入，才能在将来赶上先进国家的水平。参考文献1 冯伯森， 王秋雨， 胡玉兴. 动物细胞工程原理与实
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