1、miR-22,199 原位杂交流程一、操作流程1、常规石蜡切片(4m)脱蜡至水 ;2、PBS 洗 33min;3、柠檬酸盐 98 15min; 4、5g/ml 蛋白酶 K 37 5min，PBS 洗 33min。5、0.1mol/L 甘氨酸 PBS 洗 10min.6、0.25%乙酸酐的 0.1mol/L 三乙醇胺(pH8.0)洗 10min，PBS 洗 10min。7、预杂交 0.2SSC50甲酰胺 60min 37。8、杂交：每片滴加 30l 杂交液（每 ml 杂交液含锁探针 15ul,约 1.5pM）用干净的盖玻片复盖，95变性 8min,立即将切片置于冰上复性，55 杂交过夜( 约 1
2、8h)。9、杂交后洗：用 605SSC 洗去盖玻片(洗下盖片即可,约 5min)；0.2SSC 洗 短暂 室温;0.2SSC 洗 60中温育 60min;滴加阻断试剂,并孵育 10min;10、免疫组织化学检测：3%H 2O2 阻断内源性过氧化物酶 室温 10min;滴加 McAb 抗 Dig IgG 一抗(REF/Cat.No.84-0146,lot#:305359;invitrogen 公司产品) 37 30min;PBS(内含 0.05%Tween20)洗 33min羊抗鼠-HRP 多聚物酶标二抗(REF/Cat.No.84-0150,lot#:651671A;invitrogen 公司
3、)PBS(内含 0.05%Tween20)洗 33min;0.04%DAB+0.05% H 2O2 10-30min;Mayers 苏木精轻微复染，显色完成后流水终止反应1盐酸酒精 10 秒分色自来水冲洗 5 分钟2 次氨水溶液 3060 秒自来水冲洗 35 分钟。脱水、透明、封片二、议器设备1、冰箱 海尔 BCD-256KFD 青岛2、隔水式恒温孵育箱 GNP-9080 上海精宏实验设备有限公司3、切片机 LEICA RM2145 德国 LEICA 公司4、展片机 Leica HI1210 德国 LEICA 公司5、烤片机 Leica HI1220 德国 LEICA 公司6.、水浴锅7、杂交
4、炉 Biometra Compact Lin OV04 三、试剂和探针(一)探针1、miR-199 Dig 标记的核酸锁探针 合成于 Exiqon 公司Gene ID: MI0000242GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC2、miR-22 Dig 标记的核酸锁探针 合成于 Exiqon 公司Gene ID: MI0000078GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUGAAGAACUGUUGCCCUCU
5、GCCExiqon 公司 生产的 MiRCURYTM 原位杂交检测探针具有高度的亲和活性和高超的碱基错配识别能力，无论是组织切片、细胞，或是经过甲醛固定、石蜡包埋的标本，都能精确检测其中的 miRNAs。LNA 是高亲和力的核酸拟似物，它能够显著提高 DNA 寡核苷酸的杂交效率。Exiqon 合成的原位杂交检测探针运用了掺入 LNA 的设计（约掺入 30%LNA） ，每融合一个 LNA 能够使 DNA/RNA 杂交的 Tm 值升高 2-10 度。Tm 值的升高能增强 LNA-DNA/RNA 双链的稳定性，使即使20nt 的短探针也能拥有较高的 Tm 值（70 度以上） ，以满足严格杂交条件下的原位杂交实验。MiRCURYTM 原位杂交检测探针主要优点： 高灵敏度，可以检测普通 oligo 探针检测不到的微量 miRNAs。 覆盖所有已知的 miRNAs。 高特异性，能够区分单碱基或 2 个碱基差异的 miRNAs。 适应多种标记方法，如 DIG、生物素、荧光。 提供完整的实验步骤。
