1、western blot 失败经验总结 1我做了很久的 WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事如果单独做 WB 的话，感觉以 “快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给 loading buffer 裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入 loading buffer100 度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于 WB 的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然 ECL 法下限是 0.1ng，即 100pg），最好在 10ng 以
2、上为好。这就要求在做 WB 之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。 western blot 失败经验总结 2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶 电泳 Buffer 重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个 34 次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer 一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离
3、的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜 我用的是湿转，Buffer 一定要预冷，最好提前一天配好放 4 度；滤纸不要大过 PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入 Tank 前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。 心得 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后,15000g, 4 度, 20 分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠 0.5 克, SDS 0.1 克, 加 1*PBS 至 100ml. 再加入 PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/
4、ml PMSP 异丙醇溶液: 取 A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20 度储存组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用 PBS 冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次 30 秒,重复 3-5 次.（2）离心机 1000rpm，4 离心 10min 后，所得上清液转入超速 离心管。(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用 10000rpm, 4 度, 30 分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B 重悬，4
5、度过夜后，分装至 EP 管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4 离心 30min。（4）收集所得上清液即为膜组份。Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml L
6、eupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装 EP 管（每管约 50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70 度深冻冰箱保存。如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4 度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。考马斯亮兰测蛋白浓度：考马斯亮兰配方：G250 0.4 克, 95%乙醇 100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至 2000ml,过滤后使用。BSA 标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。配制标准液(浓度分别为 0，10，20，30，40，50ug/ul) ：1 2 3 4 53 6G
7、250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml0.5mg/ml BSA - 20ul 40ul 60ul 80ul 100ulddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul -待测蛋白配液：每管 3ml G250，2ul 样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加 2ul 样品，ddH2O 减为 96 ul，标准液浓度可适当扩大。）紫外分光光度计，595nm，用 1 号管调零，制出标准曲线, 标准方程及 R 值（R 值应大于 0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白 OD 值，算出蛋白浓度。（若加入 2ul 样品，则浓度值需除2，方为真正浓
8、度； 若加 4ul 样品，则除 4）聚丙烯酰胺电泳：1自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用 ddH2O 冲洗干净，立放于盒子内，60 度烤箱烘干备用。2配胶：凝胶储备液（30% Acr/Bise）：丙烯酰胺 29 克，双体甲叉双丙烯酰胺 1 克，加水至 100ml。（有说要棕色瓶保存，3 个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉）10%APS：0.1 克过硫酸铵，加 ddH2O 至 1 ml.(4 度保存,一周内使用)，本人都是配新鲜的用。10%SDS: 1 克 SDS,10 ml ddH2O. (不溶时,可加热 50 度左右助溶.)TEMED: 原液即可 .0.5M Tris-HCl (PH6
9、.8)；1.5M Tris-HCl (PH8.8): 9.0855 克 Tris, 加入 ddH2O 溶解后,用 HCL 调 PH 至 8.8,加 ddH2O 到 50ML配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！本人做的是 70KD 和 17KD 的分子量，分别配了 10%和 12%的分离胶，4% 的浓缩胶。摇动溶液充分混合（不要过于剧烈以免引入过多地氧气）灌入 2/3 的分离胶后（估计距梳子底 1CM）应立即用 ddH2O 封胶。等到能看清水和胶的分界线，则可配浓缩胶。用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。插入梳子，不要有气泡。蓝色字体是从别人贴子上看到的这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺”
10、 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺 ”为 1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有 3% 的蛋白质。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于 4，可至少存放 1 个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸 3 分钟），加入 10%AP（0.70.8:100, 分离胶浓度越高 AP 浓度越低， 15%的分离胶可用到 0.5:100）及 TEMED（分离胶用 0.4:1000, 15%的可用到 0.3:100
11、0，浓缩胶用 0.8：1000）PAGE 配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在分子克隆上有详细的论述。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜最好用小指管配 AP（写日期）保存在-20 度，超过 2 周的 AP 扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的 AP 都别用。 胶浓度10% 时可用 0.1%的 SDS 封，浓度10% 时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0.1%的 SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净，然后加少量 0.1%的 SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。按照想
12、要的浓度加入 LOADING BUFFER 配制。本人按每孔总体积 20ul, 终浓度 1* RSB，含 50ug 蛋白混合样品，不足的体积用 1* PBS 补足。短暂离心后，沸水中煮 5 分钟，放室温，用时再短暂离心。例如. 50ug/20ul，做 2.5 孔, 即 50ul，125ug1 2 3 4蛋白浓度 1033 ug/ ul 1391 ug/ ul 1487 ug/ ul 1903 ug/ ul所需体积 12.1 ul 9 ul 8.4 ul 6.6 ul5*RSB 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul1* PBS 27.9 ul 31 ul 31.6 ul 33.4 ul
13、5*RSB: 1.89 克 Tris-HCL(PH 6.8), 5 克 SDS, 0.125 克溴酚蓝 , 25ML 甘油.(很粘稠)Beta-巯基乙醇用时现加,按 25%比例.10* PBS: Nacl 4.25 克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调 PH 到 7.2-7.4,加 ddH2O 到 500ML约 30 分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入 1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔. 微量进样器逐个加样,空泳道加入 1* RSB. 两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为
14、100V. 观察 MARKER 的情况, 适时终止电泳.建议说目的带要跑到分离胶的 2/3 处比较好,但本人一直都在上 1/3 处,结果也还可以.预染 MARKER 很重要,开始选了一个国产的 ,总是跑不好,后来换成 NEB 的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的 7.,42.17 全都包括在内.如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破
15、坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.10* 电泳缓冲液: Tris7.58 克, 甘氨酸 36 克, SDS 2.5 克, ddH2O 定容到 250ML. 不好溶,可用搅拌器.可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.转膜跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝 R250 染色约 30 分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇 30 分钟左右（有次着急只晃了 10 分钟，结果也挺好的）。开始用的 PVDF 膜, 0.45um, 用国产的 MARKER 后,总是染的不清楚, 而
16、且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了 NEB 后,PVDF 也不容易上色 (可能和 PVDF 的质量有关,我买的虽然也是 MILLIPORE,但好像比较便宜 20CM*10CM 才 50 块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。后来换成 NC 膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER 易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是 BIO-RAD 的半干转（电压不过 25V 的那款），电源是 BIO-RAD 的 PC200，70KD 的我转 5
17、0 分钟，20V，17KD 的转 20V，30 分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看 MARKER 转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说 1.2-2MA/CM2 我看了一下，我的胶大约都是 5*3 左右大的，20V 一般电流会是60-30MA 之间，要是这样算的话,最高就 30MA, 我不太清楚.如果用 PVDF 膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是 5 分钟，但也有人说不过 30 秒，不清楚。换了 NC 膜就直接放入转移缓冲液中的，晃 30 分钟左右。滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也
18、不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各 15 张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸膜胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有 MARKER 也方便记.转膜后的胶可用考染看看转膜情况.考马斯亮蓝 R250: R250 0.25 克, 甲醇 50ML, 冰乙酸 40ML, 加水到 100ML.脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇 225ML(可用乙醇), ddH2O500ML10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4 克), 30%三氯乙酸(6 克), 30%磺基水杨酸(6
19、克). 用时加入 9 倍的 ddH2O10*转膜缓冲液:70KD 分子量: Tris29 克, 甘氨酸 14.5 克, SDS 1.85 克, 加水到 500ML.用时取 10ML, 加 20ML 甲醇, 加 70ML 双蒸水17KD 分子量: Tris29 克, 甘氨酸 14.5 克, 加水到 500ML.用时取 10ML, 加 50ML 甲醇, 加 40ML 双蒸水封闭用 5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床 1 小时.5%封闭液: 1 克脱脂奶粉, 20ML 洗膜液.洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20抗体孵育将膜上的封闭液洗
20、去(轻轻晃晃就可)一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及 ECL 要求来定 .4 度,过夜.最好有那种 4 度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇 3 个小时左右.洗膜液洗 3 次,每次 10 分钟.二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1 小时.洗膜液洗 3 次,每次 10 分钟.PBS 洗 5 分钟.如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了.杂交液: BSA0.5 克, 洗膜液 50ML.4 度保存,如有混浊,重配.点蛋白试验: 在正式作 WESTERN 之前可先做这个 ,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白
21、 ,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和 ECL 试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度.取小块膜,放到 24 孔板中(PVDF 先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加 5UL,37 度烘干,再加 5UL,烘干), 加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3 小时, 室温,摇床.洗膜液洗3 次,每次 10 分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗 3 次,每次 10 分钟.PBS 洗 5 分钟.显色ECL 显影将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按 ECL 说明书配置发光液.点在膜上
22、.不同厂家 ECL 要求不一样,本人用的 ECL 二种液体 1:1 混合后,0.125/CM2, 放置 2 分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好 ,压片.若肉眼可见发光,可压 10-20 秒; 若看不到,可压 30 分钟.(再长的时间没试过,一般 30 分钟不出,就重新再回一次 ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.)转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4 度保存,最多放过 2 天,时间长了就不知道了. 小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD 半干转恒流 1mA/cm2，1-
23、1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h 以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。湿转，Buffer 一定要预冷，最好提前一天配好放 4 度；滤纸不要大过 PVDF 膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入 Tank 前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。显影:转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染 Marker 有没有转过去，如果 marker 没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。显色的话应该 ECL 好些吧，灵敏度更高呢，HRP 标记的二抗孵育完后用 TBST 充分清洗，然后加 ECL
24、 试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片 5min 以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。蛋白分子量大小分别为 21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用 2.5 A/cm2， 30min 就应该够了。湿转，按照 bio-rad 的说明，用 100mA，也得要半个多小时吧。转膜时何为湿法，何为半干法？解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个
25、浸泡在 buffer 的 Tank 里转移的，叫湿法；用滤纸吸 buffer 来做转移体系的叫半干法半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。western 显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光 ECLiii. 底物荧光 ECFiv. 底物 DAB 呈色现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只
26、要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物+ 鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 DAB 好还是 ECL 好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是 HRP 最敏感的底物；ECL 结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测 pg 级抗原。要看你实验的情况。western blot 的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤
27、膜外再包一张 3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿） ，将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用 100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于 37保温 1 小时。 5. 室温下，用 PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留
28、空气。 7袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8混合：NGS(100 微升)，印迹缓冲液中的 抗体（10 毫升） ，加在装薄膜的袋中，于室温下摇动 2 小时（或 4过夜） 9用总体积 300ml PBS-Tween 缓冲液，分 4 次在一浅盘中洗涤薄膜，每次 75ml。 10 将连接生物素的羊抗兔 IgG（40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液/100 微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动 1 小时。 11 按步骤 9 洗涤。 12 加入抗生素蛋白-HRP （40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液 /100 微升 NGS） ，于室温下摇动。注意事项： western blot 中转移在膜上的
29、蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于 western blot 检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行 western blot。实验中取胶和膜需带手套。 western blot 试验心得前两天做了一个 western blot,现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用 BSA 或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。
30、2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。3 洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于水平的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。4 其实在 western blot 中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测（如 ELISA），看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。
31、另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE 胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。5 在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型（即阴性对照）的蛋白在 37 摄氏度作用 30 分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。7 全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外激动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出来了。主要试剂1、 丙烯酰胺和 N，N- 亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺 )的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w
32、/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N ，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS ，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml 终体积。过滤后 40C 保存。4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol
33、/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。这两种缓冲液必须使用 Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL。5、 TEMED 原溶液 N，N，NN 四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v) 过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制.6、 SDS-PAGE 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲
34、液 8ml，甘油 6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇 3.2ml，0.05%溴酚蓝 1.6ml，H2O 32ml 混匀备用。按 1:1 或 1:2 比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100g。7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris ，188g 甘氨酸，10gSDS ，用蒸馏水溶解至 1000ml，得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释 10 倍。8、 转移缓冲液：配制 1L 转移缓冲液，需称取 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS，并加入200
35、ml 甲醇，加水至总量 1L。9、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液。使用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉 5%(w/v)。11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作 )，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、 Tris 缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15) 鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 过氧化物酶标记的第二抗体。15、 NBT(溶于 70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、 BCIP(溶于 100%二甲基甲酰胺，50mg/ml) 。17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5) 。18、 100mmol/L NaCl。19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5) ，5mmol/L EDTA。
