1、血型糖蛋白 A（glycophorin A，GPA）是红细胞膜上含量最丰富的唾液酸糖蛋白，由 131 个氨基酸组成，每个红细胞上约有 1106 个 GPA 分子1,2。GPA 和其它 3 种血型糖蛋白（GPB、GPC、GPD）在维持红细胞间距离，调节红细胞和血管内皮细胞及其它血细胞相互作用方面发挥着重要作用3。GPA 的氨基酸序列在第 1 和 5 位上存在多态性，反映在血清学上即为 MN 血型，M 抗原为Ser1、Gly5 ，N 抗原为 Leu1、Glu5 。1982 年，Anstee 和 Edwards 报道了 3 种能检测 GPA 上不同表位的单克隆抗体（单抗），它们中没有 1 个是抗M
2、或抗 N；此后，国外又有多例针对 GPA 非多态性表位的单抗被报道 1。这些抗体在研究 GPA 和稀有 MNS 变异型方面发挥了重要作用。我们制备并鉴定了例抗 GPA 非多态性表位的单抗，现报道如下。1 材料与方法1.1 动物免疫 以人脐血红细胞为抗原免疫 6 只 68 周龄的 BALB/c 雌性小鼠证号：SYXK（苏）2005 0001，苏州贝尔达生物医药科技有限公司，前 3 次腹腔免疫，注射 40的红细胞悬液 1ml/次，最后 1 次尾静脉注射 10RBC 样品0.5ml；3d 后取脾细胞融合。1.2 杂交瘤细胞系的建立 从小鼠眼眶取血，血清和成人 O 细胞反应，取凝集最强的 2 只小鼠脾
3、细胞与小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0（扬州大学比较医学中心李厚达教授赠予）作聚乙二醇（polyethyene glycol,PEG）（批号 P7181，SICMA 公司）融合；融合细胞在次黄嘌呤氨甲蝶呤胸腺嘧啶核苷（polyethylene glycol amsnopterin thymidime,PAT）选择性培养基（批号 H0262，SICMA 公司）中作选择性培养；阳性克隆采用有限稀释法作3 次亚克隆，直至得到单克隆细胞株。1.3 杂交瘤细胞株的筛选 采用微板凝集法筛选杂交瘤上清：加杂交瘤细胞培养基上清 20l/孔，再加 1多人份混和、GPA 阳性的成人 O 细胞 PBS 悬液20l，800
4、r/min 3min，振荡看凝集结果；然后于 37水浴箱孵育 30min，加10g/ml 羊抗鼠 IgG（批号 9546，美国 Rockland 公司）40l/孔，800r/min 3min，振荡看抗鼠球蛋白凝集试验结果。1.4 抗体特异性鉴定 用试管法将微板法筛选出的阳性克隆培养基上清与稀有MK 细胞（GPA 和 GPB 都缺失）、SsU细胞（GPB 缺失）、MM 和 NN 型红细胞（均为本室稀有血型细胞库冻存细胞）作凝集试验，鉴定抗体特异性。1.5 单抗亚型鉴定 采用 Mouse Mab Isotyping Test Kit（批号 5214K16，荷兰Hbt 公司）鉴定单抗亚型，按试剂盒说
5、明书操作。1.6 单抗结合抗原表位的特性鉴定 所得单抗分别和木瓜酶、无花果酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、唾液酸酶（批号依次为072K10411、115H05591、064K7698 、034K1507、072K10411，均购自 SIGMA 公司）处理红细胞反应4，以未处理红细胞作对照，比较凝集强度的变化。2 结果2.1 杂交瘤细胞系的建立及单抗特异性鉴定 微板凝集法共筛选出 15 株阳性细胞，经抗体特异性鉴定筛选出 2 株分泌抗 GPA 非多态性表位单抗的杂交瘤细胞株，分别为 Q6D7 和 Q7C9（表 1）。表 1 单抗特异性鉴定结果2.2 单抗亚型鉴定 所得 2 株单抗均属 IgG1 亚类
6、，Kappa 型轻链。2.3 单抗结合抗原表位的特性鉴定 2 株单抗和酶处理细胞（3 人份混和、GPA阳性 O 细胞）的反应格局类似（表 2）。木瓜酶、无花果酶、唾液酸酶处理后凝集强度均有减弱，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理后凝集强度不变，说明 2 株单抗在 GPA 上的结合表位抗胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶作用，但对木瓜酶、无花果酶、唾液酸酶敏感。表 2 单抗和酶处理 O 细胞的反应格局3 讨论国外的大部分抗 GPA 单抗经过严格的抗体性质鉴定，对抗体在 GPA 上的结合位点有比较清楚的结论58。相对而言，国内的绝大部分抗 GPA 为特异性抗 M 或抗 N，而非针对 GPA 上的非多态性抗原表位9，1
7、0。我们利用 2种稀有红细胞 MK 细胞和 S s U 细胞，结合 MN 纯合子细胞，对抗体进行特异性鉴定，证明所得单抗针对的抗原决定簇为 GPA 上 M、N 以外的非多态性表位。国际上把各种检测 GPA 上非多态性抗原决定簇的抗体统称为抗 Ena1。Issitt 等11根据蛋白酶对相应抗原决定簇的影响，将抗 Ena 划分为 3 大类：1）抗 EnaTS 是识别对胰蛋白酶敏感的抗原决定簇，不和胰蛋白酶、无花果酶或木瓜酶处理过的红细胞反应；2）抗 EnaFS 是识别对无花果酶及木瓜酶敏感、对胰蛋白酶不敏感的抗原决定簇，这些表位大多在 4958 位氨基酸残基；3）抗 EnaFR 针对的抗原决定簇抗
8、胰蛋白酶、无花果酶和木瓜酶的作用。本研究获得的 2 株单抗 Q6D7、Q7C9 和酶处理细胞的反应格局符合抗 EnaFS 的特征；另外，它们和唾液酸酶处理红细胞反应减弱，说明其抗原决定簇对唾液酸有一定的依赖性。GPA 胞外区第 39 位胰蛋白酶酶切位点后还有 3 个糖基化位点，分别位于第 44、47、50 位氨基酸上1，因此推测这 2 株单抗在 GPA 上的识别位点在这 3 个糖基化位点附近，要对其精确定位还需进一步实验证明。我们获得的 2 株单抗经鉴定虽属 IgG1 亚型，但均可直接凝集红细胞，这一现象除了和单抗效价、亲合力有关外，还可能和红细胞表面 GPA 数量众多、分布广泛也有关系6。针
9、对 GPA 不同表位的单抗在稀有血型筛选、血型糖蛋白性质分析、稀有 MNS变异型鉴定上极为有用1，也有学者将抗 GPA 应用于快速全血凝集试剂中双功能抗体的研制10。此外，“GPA 突变分析”技术的建立和应用使得 GPA成为体细胞突变研究中有价值的分子标志，利用不同荧光标记的抗 GPA，结合流式细胞仪分析，可检测人外周血中红细胞的变异频率9。因此，本研究所获得的单抗 GPA 不仅在免疫血液学理论研究上有价值，而且在其它领域也有良好的应用前景。参考文献1杰夫 丹尼尔.人类血型M. 朱自严，主译.北京: 科学出版社, 2007, 1171812Poole J. Red cell antigens
10、on band 3 and glycophorin AJ. Blood Rev, 2000, 14 (1):31433Chasis JA, Mohandas N. Red blood cell glycophorinsJ. Blood, 1992, 80 (8):186918794丁苏鄂.常用血清学检查技术M/刘达庄. 免疫血液学.上海: 上海科学技术出版社, 2002, 2122135Reid ME, Lisowska E, Blanchard D. Section 3: Epitope determination of monoclonal antibodies to glycophori
11、n A and glycophorin B. Coordinators report. Antibodies to antigens located on glycophorins and band 3J. Transfus Clin Biol, 2002, 9 (1):63726Rasamoelisolo M, Czerwinski M, Bruneau V, et al. Fine characterization of a series of new monoclonal antibodies directed against glycophorin AJ. Vox Sang, 1997
12、, 72 (3):1851917Gardner B, Parsons SF, Merry AH, et al. Epitopes on sialoglycoprotein alpha: evidence for heterogeneity in the moleculeJ. Immunology, 1989, 68 (2):2832898Siegel DL, Czerwinski M, Spitalnik SL. Section 5: Structural/genetic analysis of mAbs to blood group antigens. Coordinators report
13、J. Transfus Clin Biol, 2002, 9 (1):83979董燕, 毛建平, 刘斌, 等. 抗人 M 和 N 型 GPA 特异性单克隆抗体的制备和鉴定J. 中国免疫学杂志, 2000, 16 (2):737510 吴向东, 李保仝, 邵海枫, 等. 人红细胞血型糖蛋白 A 单克隆抗体的初步鉴定J. 医学研究生学报, 2001, 14 (1):394111 Issitt PD, Daniels G, Tippett P. Proposed new terminology for EnaJ. Transfusion, 1981, 21 (4):473（20070916 收稿，20080309 修回）本文编辑：蔡辉
