1、第三章 食品样品处理 （最耗时、最容易产生误差的环节之一）,第一节 食品样品制备,一、概述通常采集的样品量比分析需要量多，食品样品制备（preparation of food sample）是指对采集的食品样品进行分取、粉碎、混匀、缩分等处理工作，使检验样品具有均匀性和代表性，以得到可靠的分析结果。,样品制备时应采用惰性材料制成的器具，如不锈钢、聚四氟乙烯塑料等。,二、常规制备方法搅拌、切细、粉碎、研磨或捣碎等。研钵、磨粉机、万能微型粉碎机、球磨机、高速组织捣碎机、绞肉机、搅拌机等。,料理机,去除机械杂质去除非食用部分：食品理化检验中用于分析的样品通常是食品的可食部分。均匀化处理：进一步切碎、
2、磨细、过筛和均匀化处理，使组成尽可能均匀一致，具有代表性。,标准分样筛,筛目：每平方英寸上有多少个筛孔。 1英寸2.51cm,样品全部通过规定的筛孔，未通过的部分应继续粉碎后过筛，不得随意丢弃，否则将影响样品的代表性。,标准分样筛,第二节 食品样品前处理,一、概述食品样品前处理（pretreatment of food sample）是指在食品样品测定前，将样品中的待测成分转变成适于测定的形式，同时去除共存的干扰成分，必要时浓缩待测成分，将被测组分进行衍生化定量转化成易于检测的化合物，使样品能满足分析方法要求的操作过程。,样品前处理的重要性,样品前处理在整个分析过程中所占的位置是十分重要的。这
3、不仅涉及工作效率的问题，同时也关系到分析结果的可靠性问题，样品前处理是影响分析数据精确度和准确度的主要因素之一。,图1 分析过程中各步骤所花费时间所占百分比。,色谱分析过程中各步骤所花费的时间,图2、分析过程中各主要误差来源,色谱分析过程中主要误差来源,图3、未经过样品前处理的血清样品HPLC分析。,未经历过前处理的样品对分析造成的影响,样品前处理的主要目的,将目标化合物从样品基质中分离出来。 将样品中所含有的对分析仪器有伤害或对目标化合物分析有干扰的成分除去。 将样品转化为适合分析仪器对其进行分析的状态。 调节样品的酸碱度、离子强度、浓度，以便符合检测仪器的工作要求。,样品前处理的基本要求试
4、样应分解或分离完全，处理后的样液不应残留原试样的细屑或粉末；不能引入待测成分，不能损失待测成分；所用试剂及反应产物对测定无干扰；处理方法简便、省时，少用或不用有毒、有害试剂。,样品前处理方法,样品前处理手段及使用的频率,二、无机化处理,有机物破坏法，是指采用高温或高温结合强氧化等条件，破坏并去除食品样品中的有机物，保留待测成分用于分析的样品前处理方法。主要用于食品中无机元素的测定。三大类：湿消化法、干灰化法、微波消化法。,（一）湿消化法,湿消化法（wet digestion）是在食品样品中加入适量的氧化性强酸，有时还可加入氧化剂或催化剂，结合加热来破坏其中的有机物，使待测成分释放出来，形成不挥
5、发的无机化合物，以便进行后续的分析测定。该法是食品样品常用的无机化处理方法之一。,1.常用的氧化性强酸 氧化性强酸：硝酸、硫酸、高氯酸等； 强氧化剂：高锰酸钾、过氧化氢等； 催化剂：硫酸铜、硫酸汞、五氧化二钒等。,（1）硝酸（ HNO3 ）浓硝酸（6568，14mol/L），氧化能力较强，将有机物氧化生成CO2和H2O，本身分解为O2和NO2，过量的硝酸容易通过加热除去。除铂和金外，所有的硝酸盐几乎都易溶于水。硝酸易与锑和锡形成难溶的锡酸(H2SnO3)和偏锑酸(H2SbO3)或其盐。沸点较低（121.8），易挥发易分解，氧化能力不持久，易烧干。消化液中残存NOx, 可能干扰测定，需加入纯水加
6、热驱赶。单独使用硝酸不能使有机物完全分解，常与其他酸配合使用。,（2）高氯酸（ HClO4 65%70%，11mol/L） 能与水形成恒沸溶液，其沸点为203。 热的高氯酸是一种强氧化剂，氧化能力强于硝酸和硫酸。4HClO4 7O2十2C12十2H2O 除钾和氨的高氯酸盐外，一般的高氯酸盐都易溶于水。 沸点适中，氧化能力较持久，消化样品速度快，过量也易于加热除去。 在高温下HClO4直接接触还原性较强的物质，有发生爆炸的可能。一般不单独使用，而采用硝酸-高氯酸混酸分解有机物。 在未消化完全时，勿使消化液烧干，以免发生危险，随时补加硝酸。,（3）硫酸（ H2SO4 98%，18mol/L） 热浓
7、硫酸具有较强的氧化性和脱水炭化作用。 硫酸受热易分解，2 H2SO4 O2+2SO2+2H2O 氧化能力:高氯酸 硝酸 硫酸； 可使蛋白质氧化脱氨，沸点高(338)，但不能进一步氧化成氮氧化物。不易挥发损失，与其它酸混合使用，在加热蒸发至出现三氧化硫白烟时，可以除去低沸点的酸、水及氮氧化物。 碱土金属（钙、镁、钡、铅）的硫酸盐在水中的溶解度小，不宜用硫酸消化。,2.常用的消化方法（建议自学） 硫酸消化法：硫酸钾或硫酸钠提高沸点；硫酸铜或硫酸汞作为催化剂；高锰酸钾或过氧化氢作为氧化剂。,硝酸-高氯酸消化法：先加入硝酸消化，再加入高氯酸；合适比例的硝酸-高氯酸混合液浸泡过夜，次日加热消化；或小火加
8、热至大量泡沫消失后再提高消化温度，直至消化完全。加入少量硫酸以防烧干。遇到还原性组分含量高的食品样品，宜先加入硝酸氧化，冷却后再加混酸继续消化，避免发生爆炸。,硝酸-硫酸消化法：加入硝酸-硫酸混合液先加入硫酸，在消化过程中不断补加硝酸使消化完全。此法含有硫酸，不宜做食品中碱土金属的分析。含大量脂肪和蛋白质的食品样品，可在消化后期加入少量高氯酸或过氧化氢，加快消化速度。,3.消化操作技术（建议自学） 敞口消化法 回流消化法 冷消化法 密封罐消化法,（1）敞口消化法（open digestion）凯氏烧瓶（Kjeldahl flask）或硬质玻璃瓶中进行，是最常用的消化方法。,（2）回流消化法（c
9、ircumfluence digestion）测定食品中挥发性成分的时可选用回流消化装置。,（3）冷消化法（digestion at low temperature）“低温消化法”室温或3740烘箱内，放置过夜。避免易挥发元素的损失，但仅适用于含有机物较少的样品。,（4）密封罐消化法 （digestion in a closed container）采用压力密封消化罐和少量消化试剂，在一定压力下对样品中有机物进行湿法破坏。150烘箱中保温2h。消化液可直接用于测定。空白值较低。,压力密封罐,4.湿消化法操作的注意事项 采用分析纯或优级纯试剂，选用优质玻璃器皿经稀硝酸浸泡后使用。同时做消化试剂的
10、空白试验。 加入玻璃珠或碎瓷片防止暴沸，注意人身安全。加入少量消泡剂。 在消化过程中补加酸或氧化剂时，首先应停止加热，稍冷后沿甁壁缓缓加入。,（二）干灰化法,干灰化法（dry ashing）,采用高温灼烧的方法来破坏样品中的有机物，又称“灼烧法”。该法是破坏食品样品中有机物的常规方法之一。,马弗炉,瓷坩埚,坩埚钳,500600,稀酸溶解,1.提高干灰化法回收率的措施 待测组分的高温挥发损失和坩埚壁的吸留损失。 采取适宜的灰化温度：常用55025下灰化4h，灰化温度一般不要超过600。“低温灰化技术” 加入助灰化剂：加速有机物氧化，防止组分的挥发损失和坩埚吸留。测碘时加入KOH 使碘转变成难挥发
11、的KI。,选择合适材质的坩埚：石英坩埚、瓷坩埚、钢坩埚、铂金坩埚、石英纤维坩埚等。 其他措施：灰化后期加入适量的酸或水，改变盐的组成或帮助灰分溶解，解除对碳粒的包裹。,（三）微波消化法（microwave ashing）,微波湿消解法 ，微波干灰化法,敞口微波消解，密闭微波消解,密闭微波消解,样品与消化试剂密封于聚四氟乙烯消解罐中，置于微波炉内进行消解。在2450MHz的微波电磁场作用下，微波穿透消解容器直接辐射到样品和试剂的混合液，使消化介质的分析相互摩擦，产生高热。同时交变的电磁场使介质分子极化，高频辐射使极化分子快速转动，产生猛烈摩擦、碰撞和震动，使样品与试剂接触界面不断更新。样品在高温
12、下与溶剂发生剧烈作用，产生大量气体，在密闭的消解罐中形成高压，样品在高温高压状态下迅速消解。微波加热由内及外，加快了消化速度。,微波消解装置由微波炉、消化容器、排气部件等组成。,课题一,关于干法和湿法，各查找一篇将其作为样品前处理的文献，个体汇报。,三、待测成分提取、净化和浓缩,食品中有机成分含量较低而共存的干扰物质较多满足分析方法的要求,（一）提 取（extraction）,样品提取是指将待测成分从样品基体中分离出来并转移至溶液中的处理过程。 有机待测成分一般采用溶剂分离提取； 传统的提取方法：索氏提取法、振荡浸渍法、液液萃取法、挥发法、蒸馏法等； 新的提取技术：加压溶剂萃取、基质固相分散、
13、微波辅助萃取、超临界流体萃取等；趋势：小型化、少溶剂、自动化的方向发展。,提取使用的溶剂通常根据待测成分的理化性质和样品的种类进行选择。 根据相似相容原理，一般应选择对待测组分溶解度较大的溶剂以保证较高的提取效率，同时节省试剂用量和缩短提取时间；干扰杂质的溶出应尽量少，达到较高的选择性，利于下一步的净化和浓缩。,在保证提取效率和选择性的前提下，还应考虑溶剂的纯度、毒性、沸点和价格等因素。 提取溶剂应不引入新的干扰，并尽量与后续检测所使用的仪器相匹配。 对溶剂的纯度有一定要求，溶剂的沸点最好适中。太高不利于后续的浓缩，太低则会影响定容的准确性。,1.溶剂提取法（solvent extractio
14、n）,依据相似相溶原理，用合适的溶剂将某种待测成分从固体样品或样液中提取出来，而与其它基体成分分离。是食品理化检验中最常用的提取分离方法之一。,溶剂提取法,浸提法,液-液萃取法,漂洗法,振荡浸渍法,捣碎法,索氏提取法,超声波提取法,加速溶剂萃取法,（1）浸提法 （建议自学）利用样品中各组分在某一溶剂中溶解度的差异，用适当的溶剂将食品样品中的某种待测成分浸提出来，与样品基体分离。 多次提取；含水量高的样品加入无水硫酸钠；含糖量高或干燥样品加入水，以提高提取效率。,1）漂洗法：（建议自学）用合适的溶剂漂洗样品或将样品在溶剂中浸渍一定时间，使粘附在样品表面或溶于表层的待测成分提取处理。一般用于农药残
15、留的快速检测。优点：操作简便，干扰物质溶出较少；缺点：农药进入作物的深层组织时，提取不完全。,2）振荡浸渍法：（建议自学）,将样品切碎，放在合适的溶剂系统中浸渍，振荡一定时间，使待测成分转移至提取溶剂中。方法简单，同时处理多个样品，是常用的提取方法。浸渍振荡的时间较长以利于增加提取效率。,3）捣碎法：（建议自学）,将食品样品和提取溶剂一起放入高速组织捣碎机中，匀浆一定时间，使待测成分转移至提取溶剂中。该法将样品捣碎与待测成分提取同时进行，提取效率较高，但杂质的溶出也较多。,高速组织捣碎机,4）索氏提取法（Soxhlett extraction）：（建议自学）,将适量样品置于索氏提取器的滤纸筒中
16、，加入适当溶剂加热回流一定时间，将待测成分提取出来。此法提取效率高，但操作烦琐费时。 常用作提取效率比较试验的标准对照方法。,索氏提取器,5）超声波提取法（ultrasonic extraction）：（建议自学）,将样品粉碎、混匀后，加入适当的溶剂，在超声波提取器中提取一定时间。由于超声波的作用使样品中待测物迅速溶入提取溶剂中，所需时间较短，一般1530min。该法快速简便，提取效率高，是目前较为常用的方法之一。,6）加速溶剂萃取法（accelerated solvent extraction，ASE）：,将适量样品置于密闭萃取室中，在高温（50200）和加压（720MPa）条件下，用合适的
17、溶剂将待测组分从样品中萃取出来。在高温高压条件下，待测组分与样品基体之间的作用力（范德华力、氢键）被破坏，并且溶剂溶解和穿透力增强，从而可以加速待测组分的溶解；另一方面，高压使得提取溶剂在高温条件下挥发减少，并驱使溶剂分子进入样品基体内部。此法主要适用于固态和半固态样品中有机待测成分的提取。,温度、压力和加热方式是影响萃取效率的主要因素。优点：萃取效率高，时间短（520min），有机溶剂用量少，溶剂选择范围广。缺点：仪器昂贵，对含水量高的食品如蔬菜水果，样品处理较为繁琐。,（2）液-液萃取法 （liquid-liquid extraction,LLE）（建议自学）,利用溶质在两种互不相溶的溶剂
18、中分配系数不同，将待测物从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，而与其它组分分离，是一种常用的分离方法。此法适用于液态样品，或经过其他方法溶剂提取后的液态基质。,根据相似相溶原则来选择提取溶剂。对于酸性或碱性组分的分离，根据检测目的，可通过改变溶液的酸、碱性改变被测组分的极性。萃取过程中易出现乳化现象，分层不彻底，影响分析结果。,3.基质固相分散法 （matrix solid phase dispersion,MSPD）,在研磨过程中，固相萃取填料充当分散剂，依靠机械剪切力使样品匀化、组织分散、细胞裂解，样品组分均匀分散在填料表面，大大增加萃取表面积。 将样品匀化、提取、净化等过程融为一体，避免了样品
19、转溶、乳化、浓缩所造成的待测组分损失。 一般情况下，所得的萃取液可直接用于分析检测。,极性固体分散剂：硅胶、硅镁吸附剂、氧化铝，常用来提取极性待测成分； 弱极性分散剂：C18，C8 ，常用于提取中等极性到非极性的目标化合物。,课题二,关于超声波提取法、加速溶剂萃取法、液液萃取法及基质固相分散法，各查找一篇将其作为样品前处理的文献，个体汇报。,（二）净 化（clean up）,液-液分配法,液相色谱法,固相萃取,固相微萃取,凝胶渗透色谱,磺化法,皂化法,凝固法,1.液-液分配法（liquid-liquid partition） （建议自学）,利用待测组分和拟去除的杂质在溶解度方面的差异，选择互不
20、相溶的溶剂对样品提取液进行净化。,2.液相色谱法（chromatography）,利用物质在流动相与固定相之间分配系数的差异，当两相做相对运动时，在两相间进行多次分配，分配系数大的组分迁移速度慢；反之迁移速度快，从而实验样品中各组分的分离，是食品理化检验中一类重要的分离方法。柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法等。,（1）柱色谱法 （column chromatography）,上样后，选择合适的淋洗液，将待测成分顺利洗脱下来，而杂质则尽可能留在柱上。或者“分段收集”。,待测成分与杂质均留在柱子上。,固定相：硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂、 C18，C8 ，人造浮石及各种离子交换树脂等，根据待测成分和杂质
21、的种类选择。 淋洗液的选择：洗脱下待测成分，杂质则尽可能留在柱上。可参考文献，也可通过条件优化实验确定。淋洗液的用量适宜，流速也要加以控制。,3.固相萃取 （solid phase extraction，SPE）,基于液相色谱分离原理的样品制备技术。在小柱中填充适当的固定相制成固相萃取小柱。当样品液通过SPE小柱时，待测成分被吸留，用适当的溶剂洗涤除去样品基体或杂质，然后用一种选择性的溶剂将待测组分洗脱，从而达到分离、净化和浓缩的目的，是目前应用最广泛的净化方法之一。,固相萃取的发展史 对于固相萃取，曾经有多种术语表达，例如，萃取色谱（Extraction Chromatography）、吸附
22、阱（Adsorption Trapping）、液/固萃取（Liquid/Solid Extraction）等。 直到1984年J. T. Baker公司将其生产的萃取柱称之为Solid Phase Extraction Columns，“固相萃取，Solid Phase Extraction，简称SPE”才逐渐被接受为一个标准术语。,先洗脱基体或干扰物质，再洗脱待测组分；待测组分被直接洗脱下来，而干扰物质不被洗脱。,根据分离的原理不同，SPE可分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤、配合和亲和萃取。其中采用化学键合反应制备的固相材料，如C18 键合硅胶、C8键合硅胶、苯基键合硅胶等填装的固相萃取小
23、柱使用广泛。,固相萃取与液液萃取的区别,液液萃取,固相萃取,VS,4.固相微萃取法 （solid phase micro-extraction，SPME）,根据相似相溶的原理，利用石英纤维表面涂渍的固定相对待测组分的吸附作用，使试样中的待测组分被萃取和浓缩，然后利用气相色谱进样口的高温、高效液相色谱或毛细管电泳的流动相将萃取的组分从固定相涂层上解吸下来进行分析的一种样品前处理方法。,涂层：聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚丙烯酸酯（PA） 无需溶剂、操作简单、效率高、选择性好、成本低等优点。 可与GC、HPLC、CE等仪器联用，样品前处理速度提高，分析灵敏度提高。,SPME通常分为两步：第一步是吸
24、附；第二步是解吸（热解吸或溶剂解吸） SPME的方式有两种：一种是直接进行萃取，适用于气体与液体中组分的分离；另一种是顶空萃取，适用于各种基体样品中挥发性、半挥发性组分的分离。 影响因素：萃取头涂层的种类、萃取时间、萃取温度、搅拌速度、pH和盐浓度等。,5.凝胶渗透色谱 （gel-permeation chromatography，GPC）,又称体积排阻色谱。根据多孔性凝胶对不同分子大小的排阻效应进行分离的色谱技术。选择不同孔径的多孔凝胶作为固定相，流动相带动样液在柱内移动，大分子不能渗透到凝胶空穴内部而被排阻，因而被较早地洗脱下来，由于小分子可以渗透到凝胶空穴内部而较晚流出，从而使相对分子量
25、不同的物质达到分离。,GPC已成为农药残留分析中一种常用、有效的净化方法。农药的分子量一般小于500，而样品中的色素、油脂、生物碱、聚合物等大分子杂质，先于农药分子被洗脱下来，从而实现分离。,6.磺化法（sulfonation）,脂肪与浓硫酸发生磺化反应，在分子末端引入磺酸基团，生成极性较大且易溶于水的化合物。主要用于对酸稳定的待测成分的净化，以除去样品中的脂肪、色素等干扰。,7.皂化法（saponification）,利用脂肪与碱发生反应，生成易溶于水的羧酸盐和醇，从而除去样品提取液中的脂肪，可用于某些对碱稳定的待测成分的净化。,（三）浓缩（concentration）,直接水浴浓缩法,气流
26、吹蒸浓缩法,真空离心浓缩法,减压蒸馏浓缩法,浓缩的目的：1.减少样液的体积，增加待测成分的浓度；2.转换溶剂。,1.直接水浴浓缩法,若需要回收溶剂，可采用蒸馏装置。 主要适用于非挥发性待测组分样液的浓缩。 缺点是只能用于体积较小、溶剂沸点较低的样液的浓缩，必须在通风厨中操作。,2.气流吹蒸浓缩法,3.减压蒸馏浓缩法,旋转蒸发仪,浓缩速度快，使用温度低，待测物损失少，适用于大体积样液的浓缩。 同时只能处理单一样品，样液还须转移、定容，且必须在通风厨中操作。一般不要蒸干。,K-D浓缩器,可将需要浓缩的样液直接浓缩到刻度管中，无需转移样品，适合于中等体积（1050ml）提取液的浓缩。 浓缩易挥发性溶剂。,4.真空离心浓缩法,思考题（P38）,1、样品无机化处理的方法有哪些？各有什么优缺点？ 2、如何提高干灰化法的回收率？ 3、简述样品提取、净化、浓缩的主要方法。各有何特点？ 4、试阐述基质固相分散法的原理。 5、简述快速溶剂萃取技术的优点。 6、固相萃取和固相微萃取技术有何异同？,
