1、变性梯度凝胶电泳系统介绍变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis, DGGE）分析 PCR 产物，如果突变发生在最先解链的 DNA 区域，检出率可达 100，检测片段可达 1kb，最适围为 100bp-500bp。基本原理基于当双链 DNA 在变性梯度凝胶中进行到与 DNA 变性温度一致的凝胶位置时，DNA 发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的 DNA 链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的 PCR 引物最好在5末端加一段 40
2、bp-50bp 的 GC 夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。这个方法是应用最早也是最常用的突变筛查方法之一，在过去的十年中经历了很大的改进。1.原 理 如果 DNA 双链分子全长不断增加温度或用化学变性剂处理，两条链就会开始分开（解链） 。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。GC 碱基对比 AT 碱基对结合得要牢固，因此 G.C 含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力（称作“堆积 ”） 。解链温度低的区域，通常位于端部称作低温解链区（lower melting domain） 。如果端部分开，那么双螺旋就由未解链部分束在一起，这一区域便称作高温解链（
3、high melting domain） (图 1) 。图 1如果温度或变性剂浓度继续升高，两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据首要的一点是：DNA 双链末端一旦解链，其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降。图 2第二个根据是，如果某一区域首先解链，而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解链温度，因此，将样品加入含有变性剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开（图 2, 1 和 2 道） 。最终，如果一双链在其低温解链区碱基错配（异源双链） ，而与另一等同的双链相比差别仅在于此，那么，含有错配碱基的双链将在低得多的变性剂浓度下解链。事实上，样品通常含有突变、正常的同源双链以及配对的异源双链，后
4、者是在 PCR 扩增加时产行的。而含有错配的双链（图 2 中的 3 和 4 道）通常可以远远地与两个同源双链（图2 中 1 和 2 道）分开，这种分离效果使该方法灵敏度很高。为使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果，必须先选择所要研究的 DNA 范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以按图 2 所示的正交变性梯度实验进行经验性地解决。变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分，因为这时多数分子处于部分变性状态这使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离。现在多数分析是用“GC 夹板”（clamp ）技术进行的。它是将一段长度为 30-50 碱基，富含 GC 的 DNA 附加到双链的一端以形成一个人
5、工高温解链区。 这样，片段的其他部分就处在低温解链区从而可以对其进分析。这一技术使该方法可检测的突变比例大大增加，其中许多操作今天已普遍使用。本表仅列出该方法的主要的发展经过，包括使用异源双链“GC 夹板”技术， PCR 及专门的计算机程序等。PCR 反应技术的问世使非标记技术简便了许多。2.DGGE 法的优缺点优 点 :1.DGGE 的凝胶具有变性剂浓度梯度，可以根据 DNA 片段的退火温度分辨不同片段，分辨率可以达到一个碱基2.DGGE 有精密控温系统，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高的可重复性3.DGGE 可以对环境样品 DNA 的 PCR 产物进行分离进而克隆测序，比一般聚丙烯酰胺凝胶
6、电泳仅仅根据片段长短进行分离前进了一大步。4.几乎可以检出所有突变 5.可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 6.无须对引物标记 7.可检测出象甲基化之类的 DNA 修饰 缺 点 :1.需要专门的电泳设备 2.需要在上游引物前端合成“GC 夹板”3.DGGE 的应用环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物等生物的多样性分析（土壤、水等样品，无需培养，直接提取 DNA 扩增检测） ；动、植物体内外共生微生物的检测；食品微生物的检测；医学领域碱基突变的检测，杂合子检测等等。变性梯度凝胶电泳系统使用说明一、系统仪器组成：电泳控温槽一台、电泳支架两套（包括玻璃板三副、梳子两副、夹子 1
7、6 个） 、程控电泳仪一台、梯度混合仪（含转子、电源）一套、缓冲液虹吸泵一副。规格及参数：电泳控温槽：高温钢化玻璃控温槽：（长）51cm（宽）28cm（高）24cm，总容积 34 L（推荐电泳缓冲液最佳体积 21L） 。全封闭设计，水蒸汽凝结后会重新回到槽中，不必补充缓冲液并防止蒸汽扩散到实验室内。温度数字显示，加热器工作、保温状态显示。加热器功率1500W，控温精度： 0.1，控温范围：室温至 70，自动过热保护。可调速循环匀温水泵，出水口方向及出水量大小可调。开盖自动断电保护装置，开盖后所有电源完全断开，确保安全。开盖后须重新启动电源。仪器可连续 24 小时工作。电泳支架及附件玻璃板：（长
8、）22cm（宽）17.7cm 。一块带有有凹槽，另一块粘有和梳子同样厚度有边条和密封边条，使用时将两块玻璃对齐合起，在电泳支架底部放好橡胶条，按图安装在支架上，旋紧压紧螺丝，使玻璃内部形成一个三面密封的槽，灌入去离子水检查是否有渗漏，不漏可放好待用。梳子标准配置为 1mm 厚 21 齿，如需其它规格可定制。3电泳仪：功率 300 W，恒流范围 0- 150mA，恒压范围 0- 200V ，微脑控制可编程分段定时定压。开机后按“转换”键，组合“设时” “设分” 键，可选择第一时段或第二时段的电泳时间，调节旋扭可调电泳电压，设定完成后按启动键，秒脉冲显示灯闪动，表示即开始工作。时间显示为倒计数式，
9、两时段都减为 0 后，仪器自动关闭。二、实验流程DNA 样品的提取 PCR 扩增 DGGE 电泳 带型分析 特征条带的测序。三、DGGE 过程1 试剂的配制和梯度变性胶的配方1.1 40%的凝胶单体（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺：37.5/1）：称取 38.93g 丙烯酰胺和 1.07g 甲叉双丙烯酰胺，加入去离子水定容至100ml 后用 0.45m 的滤膜过滤后装入棕色瓶 4C 保存。1.2 100%变性剂：取 42ml 去离子甲酰胺、42g 尿素，用去离子水定容至 100 ml 后用 0.45m 的滤膜过滤后装入棕色瓶 4C 保存。1.3 50TAE 缓冲液（Tris 2mol/L， 冰醋酸
10、1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0）1.4 10%过硫酸铵溶液（W/V，为保证良好的引发效果，建议现配现用）1.5 TEMED（分析纯）梯度变性胶的配方（浓度为 8%的变性胶）组份 变性剂浓度 60 50 25 0凝胶单体 2.8mL 2.8mL 2.8mL 0.8mL100变性剂 8.4mL 7mL 3.5mL 050TAE 0.28mL 0.28mL 0.28mL 0.08 mL双蒸水 2.52mL 3.92mL 7.42mL 3.12 mL除引发剂和催化剂外的总体积 14mL 14mL 14mL 4mL灌胶前加入引发剂：10过硫酸铵 60L 60L 60L 25L灌胶前
11、加入催化剂：TEMED 8L 60L 60L 5L梯度变性胶的配方（浓度为 6%的变性胶）组份 变性剂浓度 60 50 25 0凝胶单体 2.1mL 2.1mL 2.1mL 0.6 mL100变性剂 8.4mL 7mL 3.5mL 050TAE 0.28mL 0.28mL 0.28mL 0.08 mL双蒸水 3.22mL 4.62mL 8.12mL 3.32 mL除引发剂和催化剂外的总体积 14mL 14mL 14mL 4mL灌胶前加入引发剂：10过硫酸铵 60L 60L 60L 25L灌胶前加入催化剂：TEMED 8L 60L 60L 5L2 梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳2.1 将两块
12、玻璃对齐放入电泳支架上（带缺口的玻璃缺口朝上并位于内侧） ，旋紧固定螺丝并夹好夹子。注入去离子水，检测是否漏水后倒出去离子水。2.2 配制高变性剂浓度凝胶溶液和低变性剂浓度凝胶溶液，在灌胶前加入适量的 10%过硫酸铵溶液和 TEMED 作为聚合引发剂和催化剂并充分混匀（胶浓度根据 PCR 产物片段长度选定，一般 150-400bp 的选用 8的胶，400bp 以上的选用 6的胶；变性剂浓度范围根据文献报道并针对具体样品做适当调整，使最终条带位于变性胶中部。引发剂和催化剂的具体用量可以根据气温以及实验人对聚合速度的要求进行调整，表格中列出的是建议用量） 。关闭梯度混合仪的两个阀门，将高浓度变性剂
13、凝胶溶液加入梯度混合仪靠近出口的一端，将低浓度变性剂凝胶溶液加入另一端，并打开磁力搅拌器。2.3 先打开梯度混合仪出口端阀门，待液流稳定无气泡时将针头插入两块玻璃缝隙中部，接着打开梯度混合仪中间阀门开始灌胶。2.4 待凝胶灌至距上端 1.5cm 处时停止灌胶，加入 1mL 去离子水液封胶面，待凝胶聚合后，配制不含变性剂的 0%凝胶（别忘记加引发剂和催化剂） ，用移液器灌胶，插好梳子，待凝胶完全聚合。2.5 拔出梳子，将电泳支架放入恒温电泳槽（已装入 1TAE 缓冲液 21L，温度设置为 60C，插上电极和缓冲液循环管，将各个PCR 产物与 Loading buffer 混匀（选用普通的核酸琼脂糖电泳的10Loading buffer） ，然后用微量上样器吸取样品并加到各个上样孔中（每个孔的 DNA 含量为 500-800ng，PCR 产物在琼脂糖电泳时与 Marker 比较计算其大概含量，使得梯度变性胶每个孔样品中的DNA 含量尽量一致） 。 一切就绪后，准备开始电泳，电压设定为第一阶段 60V，1h 第二阶段 100V，16h，电泳仪全自动定时分段编程。2.6 电泳结束后，拿出电泳架取出玻璃，将一侧玻璃揭去，用EB 或 SYBR Green 染色 30min 后取出凝胶，置于凝胶成像仪中拍照。
