1、山东大学硕士学位论文苹果多酚的高效液相色谱检测方法的建立姓名：杨建荣申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：司芝坤20060315原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：趁叠墓 日期： 婴：；关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授
2、权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：避 导师签名：日 期： !丝：2山东大学硕士学位论文摘 要建立了苹果中九种多酚物质的HPLC(高效液相色谱)检测方法。根据中性酚和酸性酚在结构及性质上的差异，采用不同的流动相体系、不同的柱温、不同的吸收波长等不同的色谱条件来分别分离多种中性酚和酸性酚以及测定其含量。先对七种中性酚标准品和两种酸性酚标准品的色谱分离条件分别进行了探索和优化，最终确定色谱柱选用C18色谱柱，流动相用2mM磷酸水溶液和甲醇，分别建立起苹果中中性酚和酸
3、性酚的HPLC检测方法。本文以市售小国光苹果和红富士苹果为试材，将苹果果实分为果皮、果肉和果核三部分，冷冻干燥后，粉碎并真空包装，冷藏保存。提取苹果中的多酚时，为避免将糖类等物质共同提取出来而影响多酚的纯化和测定，采用乙酸乙酯为提取剂，将苹果多酚从样品的水溶液中提取出来。根据中性酚和酸性酚在不同pH条件下的存在状态不同，确立了用乙酸乙酯在pH=20时分离提取酸性酚，在pH=70时分离提取中性酚。利用所建立的HPLC方法分别准确测定了小国光苹果和红富士苹果的果皮、果肉和果核中酸性酚、中性酚的种类和含量，并比较了不同苹果品种、苹果不同部位所含多酚的种类和含量的差异。本文所建立的苹果多酚的HPLC的
4、检测方法对苹果多酚含量的准确测定可以对苹果多酚的开发利用提供理论依据。结果表明：1中性酚的分离采用浓度梯度洗脱，60分钟内甲醇的浓度从2升为40，相应的磷酸溶液浓度从98降为60：最大吸收波长为280nm，柱温为40“C，以及在采用不同流速的条件下，七种物质的峰得到了较好的分离，分离度均大于15。2酸性酚的分离以30的2mM磷酸水溶液和70的甲醇作为流动相，柱温为25，最大吸收波长为320am，两种酸性酚完全分离，分离度为25。3该方法的最低检出限为O0220072 j g，加标回收率均大于90，相对标准偏差为1124，说明该方法准确可靠。4苹果中多酚含量较多的是(+)儿茶素、(一)表儿茶素、
5、果皮中的芦丁、绿原酸和p一香豆酸；果皮中中性酚的含量都高于果肉和果核中中性酚的含量；但对酸性酚而言，果核中酸性酚的含量高于果皮和果肉中酸性酚的含量：芦丁和槲皮素在小国光苹果的果肉和果核中未检测出来。红富士苹果果皮中中性酚含量最高，果核中酸性酚含量最高：芦丁在果核中山东大学硕士学位论文未检测出，槲皮素在果肉和果核中皆未检测出。在果皮申，小国光苹果中中性酚和酸性酚的含量都高于红富士苹果中多酚的含量：在果肉中，在小国光苹果(+)一儿茶素的含量比红富士苹果中的含量要低果核中两种苹果中中性酚的含量相差不大，但酸性酚的含量差别较大，小国光苹果中酸性酚的含量比红富士苹果中的含量要多。关键词：苹果多酚：提取：
6、HPLC；含量2山东大学硕士学位论文ABSTRACTSeven neutral phenolic compounds and two phenolic acids in apples weredetermined by reversed phase high-performance 1iquid chromatography inthis paperAccording to the diversity between the neutral phenoliccompounds and the acid polyphenols，they are separated with differentm
7、obile phase，at different column temperature and different wavelengthof detectorAfter optimizing the chromatographic conditions of thephenolic standards(namely seven neutral phenolic compounds and twophenol ic acids)，the chromatographic separation was carried out usingmobile phase methanol as solvent
8、 A and 2mM phosphoric acid as solvent Bon Cl。columnThe apples were divided into three parts of the skin，pulpand core according to the human edible habitIn order to avoid extractingthe carbohydrate in apples，polyphenols in apple samples were extractedby ethylacetatePhenolic acids were extracted at pH
9、 2 2 by ethylacetateand neutral phenolic compounds were extracted at pH=7 from their solutionThe contents of polyphenols in Fuji apples and in XiaoGuoGuang apples weredetermined by this HPLC methodThe result will be helpful to empolderthe applesThe results are as following：1For neutral phen01ics。the
10、 gradient is a sequence of linear increments：starting with一2methanol to reach 60in 60 minutesand 2mM phosphoricacid was changed from 98to 40An additional flow rate gradient wasincluded to achieve the better separation effectsA wavelength of入=280nm was used for the detector2Phenolic acids were analys
11、ed in isocratic mode，at IOmlmin，using70methanol and 302mM phosphoric acid as the mobile phaseThe columntemperature was 25“C，phenolic acids were quantified at 320nmResolutionwas 253The detection limit were 0022一O072 u g，the recovery rate were ali3山东大学硕士学位论文above 90，the relative standard deviation wer
12、e 11一24，whichsuggested that the method i S accurate4The kind of apple polyphenols in Fuji apple is different from that ofXiaoGuoGuangThe contents of each kind of apple polyphenols aredifferentThere are(一)一Epicatechin，(+)一Catechin，Procyanidin B，Phloridzin，Chlorogenic acid，p-Coumaric acid and Phloreti
13、n in the pulpand the coreThe contents of neutral phenolic compounds in skin aremore than that in pulps and coreBut the contents of phenol ic acidsin core are more than that in skin and pulpRutin and Quercetrin werenot detected in the pulp and the core of the XiaoGuoGuang appleThecontent of neutral p
14、henolic compounds is the largest in skin in Fujiapple and the content of phenolic acids is the most in coreRutin wasnot detected in the core，Rutin and Quercetrin were not detected in thepulp and the skin of the Fuji appleIn the skin，the contents of polyphenolS in XiaoGuoGuang are more thanthat in Fu
15、ji appleThe contents of(+)一Catechin in pulp ofXiaoGuoGuang iS less than that in FujiThe contents of neutral phenoliccompounds in core of XiaoGuangGuang is almost as much as that in FujiKey words：Apple：phenol ic compound：HPLC4山东火学硕士学位论文1引言11植物多酚概述 。111植物多酚的定义及在自然界中的分布多酚类化合物是指具有苯环并结合有多个羟基的化合物的总称。多酚类化合
16、物有不同的分类方法。按照聚合度的不同，多酚可分为两大类，一类是多酚的单体，即非聚合物，包括简单酚类化合物、各种黄酮类化合物、酚酸、羟基肉桂酸等，也包括一些接有糖苷基的复合类多酚化合物，如芸香苷等。另一类则是由单体聚合而成的低聚或多聚体，统称为单宁类物质，包括缩合型单宁中的花色素原和加水分解型单宁中的没食子单宁等。其中黄酮类化合物又可分为黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮醇类、黄烷酮类、黄烷醇类、花色苷类、查耳酮类及其衍生物等：按照酸碱性的不同，多酚又可分为酸性酚和中性酚“。植物多酚是一大类广泛存在于植物体内的复杂的多元酚类化合物。许多水果如苹果、葡萄、柑橘、樱桃、桃、李、杏、醋栗、草莓等都含有一定量的多
17、酚物质。其中，简单酚类物质含量较少，主要包括儿茶酚、对苯二酚、间苯二酚等。酚酸类物质如对羟基苯甲酸等在水果中分布广泛。羟基肉桂酸类物质在各种水果中也广泛存在，并且是含量最多的酚类物质之一，主要包括阿魏酸、芥子酸、香豆酸和咖啡酸等”，但它们通常与奎尼酸、葡萄糖或酒石酸相结合，以酯的形式存在”，例如水果中最重要的肉桂酸类衍生物绿原酸，即是由咖啡酸与奎尼酸缩合形成的酯。其它重要的酚类衍生物还包括香豆酰酒石酸、咖啡酰酒石酸等。黄酮类化合物是水果中分布最为广泛的多酚类物质，其中，分布较广、含量较多的主要有黄烷醇类、黄酮醇类和花色苷类等“。水果中多酚物质的组成十分复杂，各种多酚物质在不同种类水果中的分布与
18、含量存在着很大差异，每种水果在多酚的组成与含量上都具有各自的特征。肉桂酸类是柑橘中主要的酚类组分；花色苷则是樱桃和红葡萄中主要的酚类物质旧；梨中绿原酸和表儿茶素的含量较高“”；而李子、杏、桃子中则含有大量的山奈素和槲皮素糖苷：黄烷酮和黄酮是柑橘中含量最多的黄酮类化合物“，而在其它水果中却不太常见或含量很少。此外，许多水果中还含有自己特征性的多酚物质，如酒石酸与肉桂酸形成的酯是葡萄的特征性物质：根皮苷是苹果的特征性物质”“：桃中的杨梅酮和芹菜素葡糖苷等都是其它水果中所不存山东大学硕士学位论文在的。同一种类的水果中，多酚物质的组成及含量也因品种、生长条件、成熟度及贮藏条件和时间的不同而存在着较大差
19、异。如红葡萄中的多酚含量(以没食子酸计，平均为5631 mgkg)比白葡萄中的多酚含量(平均3893 mgkg)要高得多“，红葡萄中含量最多的酚类物质是花色素类，而在白葡萄中却为黄酮醇类“”。同为越橘属植物的果实，欧洲越橘，笃斯越橘和蔓越橘中主要的酚类物质为花色素类，而牛浆果中则为黄酮醇类和原花青类。关于水果中多酚物质在果实发育及贮藏过程中的变化己有较多的研究。在对苹果和梨发育过程中儿茶素类和羟基肉桂酸衍生物的变化的研究中发现，这些物质是在果实发育早期形成的，但在果实的快速生长过程中含量急剧下降，直至果实成熟“。有研究结果证实在葡萄发育过程中也存在类似的变化“”。通过研究发现随着果实的成熟，草
20、莓、树莓中酚类物质含量也有很大变化“。即使是同一水果，不同组织中多酚的组成和含量也不相同。在葡萄果实中，大部分的酚类物质存在于果皮和种子中，红葡萄中的比例为63和33，白葡萄中为71和23，果汁中大约为25。在葡萄的果皮、果浆和种子中，多酚成分特别是花色苷在三个区域差别很大，葡萄果皮中的多酚主要为花色素类、黄酮及白黎芦醇等，种子中主要为儿茶素类、槲皮苷、原花青素、单宁等，而果汁中主要为花色素和酚酸类“。112植物多酚的基本结构植物多酚的基本结构最早是在50年前由德国化学家Gaisman和Hinlaina提出的。首先提出了黄烷的基本结构，见图l中的(1)。其结构是由黄烷核(吡喃环，用“C”表示)
21、为中心结合有二个苯环(用“A”、“BJ，表示)所组成的。在A环或B环之一上，因结合有多个羟基，所以又称为酚类或多酚类。凡C环2，3位是单键的为无色物，是双键的皆呈黄色。在C环4位上有酮基的称为酮，又因C环2，3位是双键呈黄色，所以称黄酮，见图1中的(2)。这种由C6-C3-C6基本构架所组成的一类化合物，统称为黄酮类化合物。除花色素外，在C环3位上有羟基的，称为醇，如黄酮醇，见图1中的(4)、(7)、(8)等。根据各环上所结合的羟基数和结合位置、B环的结合位置、C环中是否有双键及C环是否闭合等情况可分为多种物质，如黄酮、异黄酮、黄酮醇、异黄烷酮、黄烷醇、黄烷酮醇、查尔酮等，见图6山东火学硕士学
22、位论文1。由于结构上的不同，它们的生物化学特性和生理功能也各不相同。：拶；嘴。啭啦妒嗨B(1)黄烷 (2)黄酮(T)黄烷醇她国固啦罐占 (】o；花烷=薛 (11)：尔酮图l 黄酮类化合物的基本结构113植物多酚的生物活性及应用1131植物多酚的生物活性多酚类化合物是优良的氢或中子的给予体，对能引起生物组织膜因产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的超氧阴离子(O!一)和羟基自由基(0H)等，有明显的清除作用，从而起到对生物组织的保护作用“。因此多酚类物质是一种非常好的天然抗氧化剂。自由基被认为是引起人体衰老和引发某些慢性疾病的因素之一。当人体内的自由基产生过多或清除过慢，就会转而攻击各种细胞器官并
23、使之受到损伤，从而加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。多酚可提供碎灭各种活性氧自由基所需要的氢(H)，从而清除自由基，抑制过氧化作用，保护各器官的细胞膜结构。据荷兰研究工作者对7个国家的免疫学调查，凡黄酮类化合物摄入量多的，患冠状动脉疾病的人和死亡率均较低“。另据调查，尿中黄酮和异黄酮含量高的，乳癌等癌症的死亡率较低。日本人因食用大豆较欧美多，因此日本人因患冠状动脉疾病而死亡的人的比例较低“。因此，有专家建议对果蔬、豆类消费较少，或以方便主食为主的人群，应适当摄食多酚类物质，以预防疾病的发生。X旺山东大学硕士学位论文由于多酚类物质象维生素、无机盐等一样对人体有着重要的生理保健功能，因而将其列在第
24、六营养素膳食纤维之后，被称之为第七类营养素他”，而且这类物质都来自于天然植物，基本上不存在毒副作用，因此越来越受到人们的重视。1132植物多酚的应用11321抗氧化、清除自由基自由基是由氧化反应而产生的对身体有害的物质。自由基会破坏健康的细胞，侵害人体内的蛋白质、酶等物质，造成人体组织器官受到破坏，加速机体的衰老进程并诱发癌症以及心脑血管等各种疾病。多酚作为一类氧化还原电位很低的还原剂，具有很强的供氢能力，H+与羟基自由基(OH)结合，能使之还原为惰性化合物或较稳定的自由基，从而清除体内过多的有害自由基”“。2000年，科研工作者比较系统地研究了苹果多酚的抗氧化性以及清除自由基和超氧化自由基离
25、子能力的性质。在对B一胡萝h素亚油酸的抗氧化实验中发现原花青素类和槲皮苷配糖体的抗氧化活性最强，而根皮苷的活性最低。在对DPPH(N，N一二苯基三硝基苯肼)自由基的清除能力对比试验中发现苹果多酚中除了根皮苷外，所有多酚的清除能力皆高于v。和v。它们的活性顺序依次为槲皮苷配糖体原花青素类绿原酸类。3一羟基根皮苷根皮昔。超氧化自由基清除实验中发现低聚原花青素(表儿茶素、三聚体、四聚体)的活性最强，并且所有的苹果多酚的清除能力均高于V。和v。“。11322对微生物的抑制作用以单宁为主体的多酚对微生物具有广谱抗性(包括对丝状真菌、酵母、细菌、病毒的抑制)。作为次生代谢产物，多酚不仅能抵御食草动物对植物
26、体的损害，同时也阻止了微生物的侵袭，包括提高对各种病原菌的耐受力和保护受伤部位。除了抑制植物致病菌外，多酚对动物体内和其它环境中多种微生物的生长都能产生明显的抑制作用“。对细菌的最低抑制浓度范围一般在0012一lgL之间，对丝状真菌为05-209L，对酵母菌为251259L”。除了对细菌、真菌有抑制作用外，多酚对植物致病病毒如烟草花叶病毒、烟草坏死病毒、芜青皱叶病毒等，动物和人的致病病毒如蛇毒、流感病毒、胞疹病毒、痘病毒、狂犬病毒等都有一定的抑制作用。山东大学硕：J二学位论文11323对酶的影响多酚和生物大分子如蛋白质、多糖的结合特性以及与金属离子的络合特性等化学性质使其具有多种生物活性，而这
27、些生物活性最本质的方面体现在多酚对酶的影响上。多酚对酶促反应的影响作用可能是几方面因素共同作用的结果“。据报道多酚能抑制血管紧张转化酶(ACE)。用多酚及EGCG(表没食子儿茶索没食子酸酯)处理小白鼠，可抑制小白鼠皮肤线粒体脂氧合酶的活性和脂质过氧化。对人工诱变致癌的研究表明，多酚还可抑制肿瘤细胞NADPH细胞色素还原酶及细胞色素D一450活化系统的活性。以含多酚的饲料饲喂小鼠，可使肝脏GSHS一转换酶、SOD超歧氧化物酸化酶以及全血中GSHPx的活性增加幽1。11324抗衰老衰老的自由基学说是DHarman 1955年提出的，在众多衰老理论中一直占有重要位置。该学说认为，人的衰老和致病因子与
28、机体活性氧自由基(OFR)有直接关系，若这类自由基超过生理的局限，则对多聚不饱和脂肪酸、糖、蛋白质和核酸等生物大分子产生损伤，导致细胞功能衰退及代谢紊乱，诱发多种疾病产生。因此，过量自由基与衰老成因有直接关系”。多酚能提高人体内酶类自由基清除剂SOD、CAT和GSHPx等的活力，延缓衰老的进程。实验证实：服用多酚的动物，平均寿命可以延长361至499，多酚抗衰老效果较V。高18倍左右。因此多酚可以用来开发抗衰老的医疗保健品。11325抗突变及抗癌多酚对食品或环境来源的苯并芘等致癌物的致癌性起抑制作用。最近，日本学者进行了“苹果多酚化合物抗肿癌作用”的研究，该合作研究小组在用小鼠做动物实验和细胞
29、培养的验证试验中确认：苹果多酚化合物具有抑制癌细胞增殖的有效作用。虽然，动物的细胞一旦癌化，就会不断增殖和引起各种不同脏器的疾病，但是经移植皮肤癌细胞和乳腺癌细胞的小鼠喂食含l苹果多酚化合物的水溶液以后，其生存天数和肿瘤大小与不摄食苹果多酚物的对照组相比，都优于对， ，照动物，说明了苹果多酚物具有抗癌效果”“。11326抑制高血压、高血脂及心脑血管疾病日本学者在研究苹果多酚对血管紧张转化酶(ACE)抑制活性的实验中发现：苹果多酚中的缩合鞣质类约占总多酚的一半，且其对ACE的抑制活性比茶多酚的山东大学硕士学位论文主要成分儿茶素和表儿茶素要高，可以作为有效的高血压、高血脂及心脑血管疾病的抑制药剂“
30、。11327防龋齿作用多酚具有很强的抑制龋齿菌转葡萄糖基酶的作用，从而防止牙垢的形成【3 31。因此，多酚对预防龋齿非常有效。苹果多酚对龋齿菌转葡萄糖基酶的抑制能力比绿茶中的儿茶素高100倍，其主要抗龋齿成分是苹果缩合单宁。因此可以将其作为添加剂用于牙膏中，既有防龋齿作用又有洁齿作用。11328治脱发作用 多酚对毛发作用方面的报道多见于日本，主要是基于它对毛囊细胞有增殖和再生功能，有学者发现，1的低聚原花青素类对刮过毛或毛发终止生长期的小鼠的毛发有再生功能f3 41。日本协和发酵公司从苹果的提取物中制成促进头发生长的药剂一药用毛活林PB，对治疗脱发有特殊增殖效果，在这种物质中加入泛乙醚及B一甘
31、草酸等物也有良好生发效果。11329抑制鱼的腥臭昧，保持鱼的鲜度鱼的腥臭味成分主要是三甲基胺。在抑臭试验中，把三甲基胺和苹果多酚混合，用气相色谱仪测定其挥发性三甲基胺的量，结果随着苹果多酚浓度的增大，其挥发性三甲基胺的量不断减少，当苹果多酚的含量为200 u gml时，挥发性三甲基胺的量减少50。水产加工中，用水洗鱼时，加入250 u gml苹果多酚，减少约70的挥发性三甲基胺【35】。113210抗皱作用皱纹的产生是一个复杂的现象，从生理角度上看，主要涉及皮肤蛋白质和结缔组织的交联和降解两类反应【36l。多酚的抗皱作用基于它能维护胶原的合成、抑J制弹性蛋白酶、协助机体保护胶原蛋白和改善皮肤弹
32、性，从而避免或减少了皱纹的产生。11321 1 防晒、美白作用芬兰大学学者曾从细胞学角度，通过紫外能源照射皮肤细胞的体外实验发现，当人的皮肤组织暴露在紫外能源中仅30min，阳光杀死细胞大约50，随着低聚原花青素的加入，大约有80的皮肤细胞免受损坏，且与V。相比具有较好的、紫外线吸收作用。1988年，美国专利6817299开发了含有60低聚原花青素提取山东大学硕士学位论文物的防晒霜口”。11321 2收敛和保湿作用多酚的收敛作用，使得含多酚的化妆品有很好的附着能力，并且可使粗大的毛孔收缩；多酚的保湿作用是基于多酚的分子中含有亲水性的酚羟基结构，此结构不仅在空气中易I吸潮，而且能够与多糖、蛋白质
33、、氨基酸、多肽等大分子形成复合物，也可以起到保湿作用【381。12苹果多酚概述苹果多酚是苹果中所含多元酚类化合物的总称。苹果中除含有丰富的植物纤维、糖、矿物质、维生素等营养成分外，还含有一定量的酚类物质。对苹果多酚的研究最早开始于对褐变的控制研究。苹果多酚是褐变反应的底物之一，并且与新鲜苹果及其制品(如苹果洲、苹果酒)的感官品质密切相关”，因此人们对苹果中多酚类物质的组成、苹果多酚与褐变的关系、多酚物质与苹果汁的稳定性及颜色变化之间的关系等进行了大量的研究。 随着对多酚生物活性及应用研究的深入发展，人们看到了这类天然产物的广阔应用前景。近年来随着苹果业的迅速发展，人们对有关苹果多酚的分离提取、
34、生物活性及应用的研究越来越多。随着对苹果多酚研究的深入发展，苹果多酚已应用到多个领域。121苹果中多酚类物质的种类和含量苹果中的多酚主要包括酸性酚类和黄酮类化合物，主要的酸性酚有绿原酸、咖啡酸、D一香豆酸等：黄酮类化合物有儿茶素、表儿茶素、原花青素等黄烷醇，和黄酮醇、异黄酮等【4 01。其中酸性酚类占总酚的l3，而黄酮类化合物则占总酚的23。根据此种分类方法，在苹果多酚的提取过程中可以对酸性酚和中性酚分别提取，高效液相色谱测定时也采用不同的色谱条件。苹果中多酚的主要成分及含量因品种、成熟度以及组织部位的不同而不同，在一些酿酒苹果品种中苹果多酚的含量高达79KgFW(鲜重计)Hll,普通的鲜食品
35、种中苹果多酚含量范围在052 gKgFW f4 21。通过实验检测到在金冠苹果幼果果皮中绿原酸的含量为19004400mgKg DM(干重计)，幼果果肉中绿原酸的含量为570020700 mgKg OM，幼果果核中绿原酸的含量为1050024900 mgKgDM4 31。有结果表明金冠苹果果肉中含有槲皮苷，而嘎拉果肉中没有检测到。嘎拉果皮中含有花青素一山越橘苷，而金冠中没有【4”。IJ东大学硕士学位论文122苹果中主要多酚物质的分子结构苹果中的多酚物质主要包括羟基肉桂酸类、儿茶素类及其聚合物、黄酮醇类、二氢查耳酮类等，各种多酚物质的结构如图2所示。“0楷+O硎H 6H南RI=HR2=OH,Ra
36、-H：(I儿茶棠Rt-OH，R2-HR3-H：(-)表儿荣壤 礤XOI OOX：蝽止单元I RJ-HPJ=OH：c+卜儿薰量单元RI-OHRa-H：()-裹儿茶素单元(+)儿茶素和(一)表儿茶素 原花青素迅佣=Cll叫c= 、；“绿原酸薅仲单元终lb单元素根皮苷根皮素和根皮苷“啦O溉H k 爹Ol-IjH图2 苹果中主要多酚化合物的分子结构13多酚的提取及测定方法131多酚的提取从植物材料中提取酚类化合物的目的就是将这些化合物从它们所存在的液泡结构中释放出来。可以通过破碎植物组织或者扩散过程来实现。前一种情况一o。勰帅山东大学颇|：学位论文溶剂萃取法主要用于分离可溶性酚类化合物，利用溶剂使酚类
37、物质从植物组织中扩散出来。影响溶剂萃取法效率的因素包括：溶剂的种类、pH值、温度、提取次数与溶剂体积、样品颗粒大小等。提取酚类物质应用最多的溶剂是甲醇以及甲醇水的混合物。丙酮是另一种广泛使用的溶剂。曾有研究比较了丙酮和甲醇的提取效率。在多酚物质的提取过程中，丙酮和甲醇似乎有截然不同的特性。研究表明，甲醇是提取儿茶素的最佳溶剂，而70的丙酮更有利于原花青素的提取。研究表明，含水甲醇由于其极性的增加，萃取与极性纤维性基质结合在一起的多酚更有效，而丙酮水的混合物提取蛋白质基质中的多酚更有效，它们能够降解多酚与蛋白质的复合体【4 61。虽然甲醇和丙酮提取多酚的效率较高，但由于它们的毒性而使其应用受到了
38、限制，因此乙醇被认为是一种经济、安全的提取溶剂。高温有助于提高萃取效率。这是由于加热提高了细胞壁的通透性，增加了被提取物的溶解度和扩散系数，降低了溶剂的粘度，因而便于提取物通过固体物质以及随后的扩散过程(过滤与沉淀)。然而，过高的温度可能降解酚类化合物，因而一般提取使用温度不超过25。随着提取次数的增加，提取效率提高。比如，用50ml溶剂提取4次比用200ml提取一次更有效。对植物材料进行连续35次的提取才能得到较高的产量。均质有助于提取过程的进行，并且有利于提取过程中与提取溶剂紧密接触。通常要加入抗氧化剂(TBHQ、BHT、抗坏血酸、亚硫酸盐)防止酚类物质的氧化。然而，对于花色素来说，在提取
39、溶剂中添加抗坏血酸是不合适的，因为这种抗氧化剂能使花青素发生降解。另外，在黄烷醇的提取过程中添加抗坏血酸可能对原花青素造成相当程度的降解破坏【47】。1312固相萃取(SPE)酚类化合物可以通过固相萃取的方法分成中性酚和酸性酚，而且由于近年来更注重提高纯度，因此用柱色谱法提取苹果多酚己得到越来越广泛的应用。Cis柱固相萃取被广泛应用于从红葡萄酒、柑桔汁、蔓越橘、葡萄汁、苹果汁及苹果酒中选择It提取酚酸和类黄酮。国外Picinelli A等人采用Extra-SepCl8柱通过调节样品的不同pH值将苹果多酚分为中性酚和酸性酚【48】。1313超临界流体萃取H叫(SFE)山东大学硕士学位论文超I临界
40、流体萃取发展于20世纪60年代，近几年被应用于从植物材料中提取多酚。超I临界流体萃取的优点是结合了气体和液体的萃取特性。超临界流体的低黏度使其具有很高的扩散能力，从而更易接近与细胞壁结合在一起的酚类化合物。而且相对高的密度使其具有较高的溶解能力，从而使提取更容易。另外，氧化或异构化(如自然发生的顺反异构)在其它更传统的提取技术中可能发生，但超临界流体萃取可以使任何可能发生的降解过程降至最低。这是因为超临界流体萃取技术缩短了提取时间，并且提取过程是在没有空气和光照的条件下进行的。超临界二氧化碳是最普遍使用的萃取溶剂，它具有惰性、低毒、不产生污染的优点，超临界二氧化碳萃取技术与传统提取、浓缩技术相
41、结合，可以制各高纯度的苹果多酚，它具有有机溶剂用量少、安全性好、污染少、得率高的优点。132酚类物质的测定方法测定植物多酚的方法很多，最常用的方法有分光光度法(如Fol in一酚法、金属络合法、香草醛一盐酸法和正丁醇一盐酸法)和HPLC方法等。分光光度法是利用不同的多酚化合物和不同的显色剂作用、显色，在最大波长处测其吸光度从而计算其含量的方法。由于显色反应的限制，利用该方法只能测出少数几种多酚的含量或以此计算出总酚的含量。而HPLC法则可以同时测出许多种多酚的含量，检测速度快，灵敏度高，最低检测限低，因而受到越来越多的关注。1321总酚含量测定(FD法)13211 FD试剂的制备501称取lO
42、Og钨酸钠、209磷铝酸和50mL 85的磷酸溶于750mL蒸馏水中，加热煮沸回流两小时，冷却并稀释至1L。13212测定将25mLFD试剂加入盛有5mL稀释至合适浓度的样品溶液的具塞试管中，然后加入759L碳酸钠溶液2mL，塞上塞子于50“C恒温水浴中保持5分钟，取出冷却，然后用分光光度计测定760hm处的吸光度。用绿原酸作标样于同样条件下绘制标准曲线，根据标准曲线计算苹果多酚提取液中总酚含量。1322绿原酸的测定方法引l将2mL 5铝酸钠的50967,醇溶液加入8mL稀释至合适浓度的乙醇提取液中，振荡混匀，将lOmL上述混合液与2mL 507,醇溶液混合均匀，测定混合液在370nm山东大学
43、硕士学位论文的吸光度。根据同时绘制的绿原酸标准曲线计算苹果多酚提取液中的绿原酸含量。 1323黄烷醇的测定方法黄烷醇类含量用香草醛一盐酸法(何照范等，1998)测定。取样品溶液05mL加入装有imL 957,醇的具塞刻度试管中摇匀，然后向其中加入1香草醛一盐酸溶液5mL，加塞摇匀后现出红色。放置40分钟后，用分光光度计测定500nm处的吸光度。同时以儿茶素为标样绘制标准曲线，根据标准曲线计算苹果多酚提取液中黄烷醇的含量。苹果果肉中黄烷醇的含量以儿茶素计。1324原花色素的测定方法原花色素的测定用正丁醇一盐酸法。取苹果多酚乙醇提取液ImL自N入具塞刻度试管中，然后向其中加入6mL正丁醇盐酸(体积
44、比为955)溶液及02ml硫酸亚铁溶液(241克硫酸亚铁溶于水，定容至1000mL)，摇匀后加塞，于沸水浴中加热40min后取出迅速冷却，以试剂空白作参比，用分光光度计测定546nm处吸光值。1325苹果多酚的HPLC方法已有文献报道苹果酒中的多酚物质的HPLC的测定方法【52】。先将苹果酒中的多酚提取出来，然后用甲醇和甲酸水溶液为流动相，采用浓度梯度洗脱，测定了酸性酚和中性酚的含量。目前的HPLC法大部分采用甲醇和水、甲醇和甲酸水溶液、冰醋酸和乙腈等为流动相，本文以磷酸水溶液和甲醇为流动相，分别探讨了不同色谱条件下中性酚和酸性酚的检测条件，建立了苹果中多酚物质的快速的HPLC的检测方法。14
45、本课题研究的意义和目的苹果是一种深受人们喜爱的水果之一，苹果是我国种植面积最大的果树树种，我们山东省许多地区的农业都是以种植果树尤其是以种植=果为主。近年来随着种植技术的改进，苹果的产量快速提高，然而却出现了苹果积压滞销、卖果难的情况，苹果价格下跌、果农收入下降。造成这种相对过剩、严重积压的问题关键就是苹果加工业的严重滞后、加工能力的严重不足。苹果除了人们可以直接食用外，目前主要的深加工产品就是榨苹果汁和生产苹果酒。产品结构单一，严山东大学硕士学位论文重影响着我国苹果加工业的发展，难以满足苹果生产快速发展的要求。因此，研究开发新的苹果深加工产品，改善我国苹果加工企业产品结构、提高企业经济效益己
46、成为当务之急。这不仅可以极大地促进苹果加工业的快速发展，而且对于提高苹果产业的整体效益、增加农民收入和促进农业结构的调整都具有十分重要的意义。苹果多酚作为一类具有生物活性的天然化合物越来越得到人们的重视。然而，目前我国对苹果多酚的开发和利用还处于起步阶段，具有很大的发展空间。因此，深入开展苹果多酚的提取及其生物活性的研究，开发出能预防衰老，抗肿瘤、抗心脑血管等疾病的一系列具有医疗和保健作用的食品、饮料和化妆品，既可以为人类健康作贡献，又可以创造出更大的经济效益，解决果农的后顾之忧。而要进行这一系列的工作，都离不开对苹果多酚的检测分析。而且对于榨汁后的苹果渣，以前都是丢弃，但通过检测发现苹果渣中
47、仍含有一定量的多酚物质，可以废物利用，变废为宝。测定苹果多酚以前多采用分光光度法，只能粗略测出总酚的含量，不能确定苹果中所含多酚的种类以及各自的含量。本文即是在对我国苹果多酚资源和现有苹果多酚测定方法进行初步调查研究的基础上，对苹果中多酚物质高效液相测定方法进行了研究和探讨，并准确分析了苹果果皮、果肉、果心中多酚物质的种类和含量，以期为苹果多酚测定方法的改进和苹果多酚的开发利用提供基础资料和参考依据。生查查兰型!兰些堡；i!：2材料与方法21实验材料红富士苹果、小国光苹果22标准品绿原酸P一香豆酸(+)一儿茶素()一表儿茶素芦丁根皮素原花青素B2槲皮素根皮苷23化学试剂甲醇(色谱纯)磷酸(分析
48、纯)乙酸乙酯(分析纯)盐酸(分析纯)氢氧化钠(分析纯)烟大市场中国药品生物制品检定所德国Sigma公司中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所德国Sigma公司德国Sigma公司中国药品生物制品检定所天津尖峰天然产物研究开发有限公司天津协和吴鹏色谱科技有限公司天津市西化特种试剂厂天津市西化特种试剂厂天津市西化特种试剂厂天津市西化特种试剂厂24主要仪器及设备Agilent 1 100高效液相色谱分析仪 安捷伦科技有限公司Agilent 1100 vwD可变波长检测器 安捷伦科技有限公司ZORBAX SBCl8柱(150mmX46mm，中5 p m)安捷伦科技有限公司冷冻干燥机 江苏大地自动化仪器厂FK13多用植物粉碎机 江苏大地自动化仪器厂RE52CS旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂真空包装机 郑州科贸有限公司山东大学硕士学位论文SBHIIl循环水式多用真空泵溶剂过滤器郑州长城仪器厂龙口市先科仪器公司25实验方法251样品的制备将苹果洗净晾干，把果皮、果肉、果核分离，分离过程中为防止发生酶促褐变，将它们分别浸泡在3柠檬酸溶液中，经冷冻干燥后用组织粉碎机粉碎，真空包装，备用。在59苹果皮干粉中加A,50mL蒸馏水，用lmolL的NaOH调pH至70，转移至分液漏斗中，加入50mL的乙酸乙酯，摇动5
