1、 荧光定量 PCR 中探针的荧光修饰基团 1. 荧光定量 PCR 两种方法 荧光定量 PCR 技术是为了测定样本中特异的 PCR 片段相对及绝对量，是一种测定特异的 PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的 mRNA的含量等。为了达到高效反应，应将实时 PCR 应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有 SYBR Green 的荧光染料法和 TaqMan 探针法，两种方法的特点及应用如下表： 名称 SYBR Green 染料法 TaqMan 探针法 引物 一对特异性的引物 一对特异性的引物和一条探针 原理 SYBR Green 一种 DNA 结合染料，能非
2、特异地掺入到 DNA 双链的小沟当中去， 在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA 中以后，便可以发出荧光。 探针的 5端有一荧光报告基团， 3端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行， 5端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。 特点 从实验成本来讲， SYBR Green 是最好的，普通 PCR 加上一点 SYBR Green 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等， 但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR 反应的检测，出现非特
3、异扩增会影响到定量结果的可靠性与重复性。 由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分，其敏感性要比 SYBR Green 高出 10 倍。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。 扩增长度 SYBR Green 法不超过 500 bp，一般选择250-400bp， 过大会影响到 PCR 扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开。 TaqMan 法的扩增片段都很小，几十或是 100 多，一般不超过 300，通常为 80 150bp。 适用实验 该法的最大优点就是可以与任意引物
4、、 模板相配合，用于任意反应体系中，如需要检测的基因很多， 而每个反应管中进行一种 PCR反应的检测可以满足实验要求，则 SYBR Green 是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，或是检测很多相同样本的同一基因，最常用的是 TaqMan 探针法。 2.TaqMan 探针 (1).TaqMan 分析探针和引物的设计原则： 探针长度：最大 TaqMan 探针长度为 30 个碱基，以获得最佳退火效果。 5端：探针的 5端不应是 G， G 有可能会淬灭荧光素，所以荧光标记染料不应结合到 G-残基，为了避免此项，所以要避免避免探针的 5端上出现 G-残基。 Tm：应介于 68-70之间。 G-C 含
5、量控制在 40-80%左右。 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免 GGGG 或更多 G 出现。 选用比较多的碱基 C。 设计引物应在设计完探针后进行。 引物设计应尽可能接近探针而又不与探针重叠。 良好的距离应为距探针 3 个核苷酸。 引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过 300bp，通常为 80 150bp. 引物的 Tm 应比探针低 8-10，通常应为至少 60。长度约 20 碱基。 避免引物、探针之间的二级结构。 探针应选 HPLC 纯化。 (2). 荧光探针保存方法如下： 荧光探针必须避光保存。 干品可于 -80保存一年以上 ,如无条件，请于 -20保存。 强烈建议用 RNase-fre
6、e 的 TE (pH 8.0) buffer 溶解探针， 这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成 100 pmol/L 的储备液，分装成小份，于 -20保存。应避免反复冻融，使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/L 或20 pmol/L)。 1. 荧光基团的种类 （ 1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素之一，在其基础上进行结构改造，可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein 适用于 Argon-ion Laser 的 488nm 光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。 与其他荧光素类衍生物一样， Fluoresce
7、in 具有光淬灭率高， pH 敏感性强与发射波谱宽的缺点。主要应用于聚焦激光扫描微阵列（ Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（ Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素， Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。分子量为 389.4，最大吸收光波长为 490 495nm，最大发射光波长为 520 530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC 在冷暗干燥处可保存多年，在水中易变坏，不能长久保存。是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色
8、较为敏感 . FITC 的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰 DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于 Argon-ion Laser 的 488nm 光谱线， Abs/Em=492/519nm（ pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。 FITC 有两种异构体 5-FITC 和 6-FITC，其中前者在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良更经常使用。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针； FITC-多肽用于 Edman 降解蛋白测序； FITC 也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素， Carboxyfluorescein，绿色荧光
9、，是荧光素衍生物的一种， 5-FAM 较 6-FAM 更经常使用。 5-FAM（ NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。与 FITC 相比， FAM 与氨基反应更快，产物也更稳定，但 FITC 结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM 也适用于 Argon-ion Laser 的 488nm 光谱线， Abs/Em=492/518nm（ pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM 主要应用于 DNA 自动测序中，标记其中的 d/ddCTP（ PE 公司），也经常用于 PCR产物定量，核酸探针等。 FITC、 6-FAM、 5-FAM 都是荧光素标记（ Fluoresce
10、in）， 5-FAM 与 6-FAM 互为异构体：而 FITC 则在与 oligo 的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键），但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。灵敏度更高。因此可由 Eclipse 或 BHQ 系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR。 TET 四氯 -6-羧基荧光素， Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。 TET 以及 HEX 均是在 FAM 基础上加以改进的，氯原子使 FAM 的吸收波长与发射波长值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了 pH 敏感性。 TET 也适用于 Argon-ion Laser 激发光源， Abs/
11、Em=521/536nm 。 HEX 六氯 -6-甲基荧光素， Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种，原理类似于 TET，适用于 Argon-ion Laser 激发光源， Abs/Em=535/556nm。 TET， HEX， FAM和 TAMRA可配合用于 DNA自动测序中， 其中 TET用于标记 d/ddATP，HEX 用于标记 d/ddGTP 或 d/ddATP。 JOE 2， 7-二甲基 -4， 5-二氯 -6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种， 6-JOE 更被广泛使用。 JOE 荧光产量高， pH 敏感性弱，适合于标记蛋白。 6-JOE 也适合于 A
12、rgon-ion Laser 激发光源， Abs/Em=520/548（ pH=9.0）。 常用于 DNA 自动测序，标记 d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与 PCR 产物定量。 （ 2）罗丹明类（ Rhodamine dye） R 110 由三苯甲烷衍生的标准荧光素（ Reference standard）之一，在其基础上进行结构改造，即可产生一系列罗丹明类衍生物。 与 Fluorescein 类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的 pH 敏感性。罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记
13、蛋白。 R110 被用于 DNA 自动测序。 TAMRA 全称羧基四甲基罗丹明，即 Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6- TAMRA 被广泛使用。 TAMRA 是少数几个能用于标记蛋白的， 6- TAMRA 适用于 Argon-ion Laser 激发光源，Abs/Em=547/573nm（ Ph=8.0）， 6-TAMRA（ NHS）常用于荧光标记试剂盒中。 6- TAMRA 主要用于 DNA 自动测序中。 Texas Red Texas Red 是一个长波长荧光素，与 Fluorescein 几乎没有波谱重叠，只适合于 Ar-Kr Laser
14、的 568nm 光谱线或 He-Ne Laser 的 594 光谱线，比 Tetramethylrhodamine 和LissamineTM Rhodamine B 波长更长，荧光量更高。 Texas Red 在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记 (Third labels)。 2. 荧光基团的选择原则： 由于目前不同荧光定量 PCR 仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择 （探针法可连接我们的荧光定量 PCR 试剂盒的编号及对应的机器型号）。 常与 5端相结合的荧光报告基团： FAM（ 6-羧基荧光素）， TET（四氯 -6-羧基荧光素）， JOE（ 2， 7-二甲基 -4， 5-二氯 -6-羧基荧光素）， HEX（六氯 -6-甲基荧光素）或 VIC， 常与 3端相结合的淬灭基团： TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明 )， DABCYL（ 4-（ 4-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）， BHQ。 （信息来自 : http:/） 1. 淬灭基团： BHQ-1、 BHQ-2、 Dabcyl 2.荧光基团： FAM、 TET、 HEX、 5-TAMRA、 ROX、 Texas Red-X、 Cy3（ TYE 563） 、Cy5（ TYE 665） 、 JOE。
