1、上海大学生命科学学院研 究 性 实 验 论 文题 目 强磁场灭菌的机制分析 负 责 人 赵佳伟 学号 13121329 电话 18964789389 所在学院 生命科学学院 专业班级 生物工程 2 班 电子信箱 项目成员 郭宸 学号 13122527 电话 18917651593 项目成员 戴文杰 学号 13122455 电话 13916934601 项目成员 夏海波 学号 13120981 电话 18717835227 项目成员 管晓翔 学号 13121038 电话 15201748724 指导教师 陈红霞 电话 66137539 日 期 2016 年 6 月 30 日上海大学生命科学学院
2、 2013 级创新实践论文0强磁场灭菌的机制分析2013 级 生物工程 2 班 赵佳伟指导教师 陈红霞摘要：热杀菌在各种杀菌技术中一直占据主导地位，然而热杀菌也有不利之处。磁场杀菌作为非热杀菌技术之一，能够在低温下杀灭微生物，保持食品的营养成分和风味。因此磁场杀菌技术成为食品杀菌领域的研究热点之一。本文以大肠杆菌、酿酒酵母和黑曲霉为例，研究一匀强磁场对微生物的杀灭作用。主要包括该磁场对微生物的灭活效果及其对微生物细胞结构的影响。关键词：磁场；大肠杆菌；酿酒酵母；黑曲霉；灭活Abstract: Thermal sterilization has been dominant in all kind
3、s of sterilization technology,but thermal sterilization has some disadvantages.Magnetic field sterilization as one of non thermal sterilization technology can kill microorganisms at low temperature, to maintain the nutritional content of food and flavor.Therefore, the sterilization technology of mag
4、netic field has become one of the hot spots in the field of food sterilization.In this paper, we take Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger as an example, to study the killing effect of a uniform magnetic field on microorganisms.The inactivation effect of the magnetic fiel
5、d on microorganism and its effect on the microbial cell structure were mainly included.Keywords: magnetic field, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, inactivation1 食品杀菌技术引起食品腐败变质的原因有很多，包括物理、化学和生物因素等，其中微生物污染引起的食物腐败变质最为普遍。食品一般含有糖类、蛋白质、脂肪等营养物质，在外界条件适宜的情况下，微生物容易快速生长繁殖。在这过程中，微生物
6、进行代谢，食品本身含有的固态大分子营养物质在水的参与下，被微生物分泌的相应水解酶分解成小分子物质，造成食品成分结构的破坏，导致食品腐败变质。食品的腐败变质不仅会导致食品营养价值的降低，还可能会引起食物中毒，甚至诱发其它疾病。食品杀菌就是在食品加工过程中，采取各种方法控制和杀灭有害微生物，从而避免食上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文1品的腐败变质，延长食品贮藏期的一种技术。食品加工中较常见的杀菌方式有热杀菌和非热杀菌等。1.1 热杀菌热杀菌在各种杀菌技术中一直占据主导地位，时至今日，热杀菌技术仍是食品工业中主要的杀菌方式 1。其主要作用是杀死微生物和钝化酶。常见的热杀菌方法有低温长时
7、杀菌（巴氏杀菌）、高温短时杀菌和超高温瞬时杀菌。热杀菌的基本原理是破坏微生物的蛋白质、细胞膜和核酸，其中以微生物细胞内蛋白质受热凝固失去代谢能力为微生物致死的主要原因。然而热杀菌的不利之处主要体现在传统的低温加热不能将食品中的微生物全部杀灭，而且高温会不同程度破坏食品中的营养成分和食品的风味。同时热杀菌需要消耗大量的能量。1.2 非热杀菌非热杀菌（冷杀菌）是相对于加热杀菌而言，无需对物料进行加热，利用其它灭菌机理杀灭微生物，因而避免了食品成分因热而被破坏。冷杀菌作为一类新型杀菌技术，其条件易于控制，受外界环境影响较小，杀菌过程中食品的温度波动很小，既有利于保持食品功能成分的生理活性，又有利于保
8、持色、香、味及营养成分，所以有诱人的发展前景。非热杀菌技术主要有超高压杀菌技术、辐射杀菌技术、微波杀菌技术、高压脉冲电场杀菌技术、脉冲光杀菌技术、磁场杀菌技术等 2-3。1.2.1 超高压杀菌超高压杀菌的基本原理：食品的超高压处理，是指利用压媒(通常是液体介质，例如水)使食品在极高的压力下产生酶失活、蛋白质变性、淀粉糊化和微生物灭活等物理化学及生物效应从而达到灭菌和改性的物理过程。其基本原理是利用了压力对微生物的致死作用。高压导致微生物的形态结构、生物化学反应、基因机制及细胞壁膜发生多方面的变化，从而影响微生物原有的生理活动机能，甚至使原有功能破坏或发生不可逆变化。超高压杀菌技术的特点：超高压
9、技术可实现均匀、瞬时、高效杀菌：可使原物质的维生素、色素、香味成分等低分子化合物不会发生变化及产生异臭物等，保持其原有性质：蛋白质、淀粉类物质超高压处理后可获得新特性的食品，延长食品的储藏时间。超高压处理过程是一个纯物理过程，瞬时压缩，作用均匀，操作安全。无化学添加剂，无需加热且在常温或低温下进行，工艺简化，节约能源，无“三废”污染。1.2.2 辐射杀菌上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文2辐射杀菌技术的基本原理为食品辐射杀菌是利用 x 射线、 射线或电子射线辐射食品，通过损害生物体细胞内的遗传物质，破坏其新陈代谢。使细胞组织死亡从而达到杀菌消毒，延长食品储存期的目的。目前研究较多的
10、辐射源为 射线、60Co 和 10MeV 以下的低能电子束。食品辐射杀菌过程中，通过辐射区域时所吸收的能量称为辐照计量通常以 Gy 或kGy 为计量单位。辐射杀菌技术的特点是辐射杀菌技术，不需要加入添加物是一种物理储藏法，且属于冷处理技术具有许多优点。辐射杀菌技术射线穿透力强，可对预先包装好的或烹调好的食品通过剂量控制和辐照工艺进行均匀彻底处理，辐照过程较易控制。可以在不破坏商品包装和食品外观又能保护食品原有性状的条件下，杀灭食品中的致病菌和寄生虫，消除在食品生产和制备过程中可能出现的交叉污染问题。辐照处理是“冷加工”，在常温下进行，不会引起内部温度的升高，可以较好地保持食品原有的鲜度和风味，
11、还可对冻结状态的食品进行灭菌，这是其他方法不可比拟的。辐照食品不会留下任何残留物，不污染环境，可提高食品卫生质量并有利于环境保护。1.2.3 微波杀菌微波杀菌技术的基本原理为微波是频率为 300MHz-300GHz 之间的电磁波。食品中的水、蛋白质、脂肪、碳水化合物等极性分子吸收微波能量之后发生碰撞，动能转化为热能，使食品发热，即热效应；生物体与微波作用还会产生复杂的生物效应，即非热效应。简单地说微波杀菌是微波热效应和非热效应共同作用的结果。微波的热效应主要起快速升温杀菌作用：而非热效应则使用微生物体内蛋白质和生理活性物质发生变异，而丧失活力或死亡4。微波杀菌技术的特点是利用微波杀菌处理时间短
12、，容易实现连续生产，对食品营养成分和风味影响较小。由于微波穿透性好所以可以在食品包装后利用微波杀菌，实践证明采用微波装置在杀菌温度杀菌时间，产品品质，产品保质期方面有明显优势。1.2.4 高压脉冲电场杀菌高压脉冲电场杀菌技术的原理是借助两个电极，将高强度脉冲电场施加到液体食品上进行灭菌。关于脉冲电场杀菌机理。现有多种假设：主要有电介质击穿理论、细胞膜穿孔效应、电磁机制模型、黏弹极性形成模型、电解产物效应和臭氧效应等。其中以细胞膜穿孔效应最具代表性。该理论认为食品中微生物的细胞膜在强脉冲电场作用下被击穿，产生不可修复的破裂和穿孔导致微生物失活 5。上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文3
13、高压脉冲电场杀菌技术的特点脉冲电场杀菌技术具有杀菌效果好、成本低、杀菌时问短、能耗低、对食品质量影响小等特点。影响灭菌效果的因素有对象菌的种类、电场强度、处理时间、处理温度、介质电导率、脉冲频率、波形、介质 pH 等。在连续操作的情况下，脉冲电场杀菌技术能较好地杀灭大肠杆菌、啤酒酵母和金黄色葡萄球菌等。1.2.5 脉冲光杀菌脉冲光杀菌技术的基本原理是利用强烈白光闪照进行杀菌。它主要由一个动力单元和一个惰性气体灯单元组成。动力单元是用来提供高电压高电流脉冲的部件，为惰性气体灯提供所需的能量：惰性气体灯能发出波长由紫外线区域至近红外线区域的光线。其光谱与到达地球的太阳光谱相近，但强度却比太阳光强数
14、千至数万倍。脉冲光中起杀菌作用的波段可能是紫外光，其他波段起协同作用。由于细菌、酵母菌等微生物都是由水、蛋白质、碳水化合物、脂肪和无机物等复杂化合物构成的一种凝聚态物质。脉冲强光有一定的穿透性。当闪照时，脉冲强光作用于其活性结构上，使蛋白质发生变性，从而使细胞失去生物活性，达到杀菌的目的 6。脉冲光杀菌技术的特点是脉冲光只处理食品表面，对食品的风味和营养影响很小，其杀菌比传统的紫外灯有更高的效率。1.2.6 磁场杀菌磁场包括静磁场和动磁场，前者的磁场强度和方向保持不变，也称恒磁场，后者的磁场方向、强度和间歇时间有规律得发生变化，如振荡磁场、脉冲磁场等。磁场杀菌技术的基本原理就是在常温下，利用强
15、磁进行杀菌，其装置主要由输液管和加在其外的螺旋线圈组成。强磁场杀菌技术突出的优点表现为：杀菌物料的温度一般不超过 5，食品的组织结构、营养成分和颜色都不受破坏，不会影响原有风味：距离线圈 2m 左右处，磁场强度衰减为相当于地磁强度，因此无漏磁问题，安全性好；与连续波和恒定磁场相比。脉冲磁场杀菌设备具有功率消耗低、杀菌时间短、对微生物杀灭力强、效率高等特点；磁场的产生和中止易于控制；由于脉冲磁场对食品有较强的穿透力，能深入食品内部，并可通过物料流动，强化料液的搅拌传质效果，致使灭菌无死角，杀菌彻底。2 强磁场杀菌的研究进展目前，对强磁场杀菌的研究主要以脉冲磁场对细菌灭菌为主。1979 年，Moo
16、re 采用强度为 0.15T，频率为 0.05Hz 的振荡磁场处理浓度为 100 个 /ml 的大肠杆菌时，发现大肠杆上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文4菌失活，采用 12T，频率为 6000Hz 的脉冲磁场处理牛奶中嗜热链球菌时，发现细胞数由22500 个/ml 降低到 970 个/ml 7。哈尔滨工业大学的李梅等研究了脉冲磁场杀菌，结果表明：脉冲磁场对细菌和藻类的杀灭具有强度和频率的选择，提高停留时间、磁场强度和脉冲频率可提高杀菌和灭藻效果8；江苏大学的马海乐等曾对西瓜汁、生啤酒进行脉冲磁场杀菌试验，结果表明产品均能达到商业无菌要求 9。钱静亚以枯草芽孢杆菌为例，就脉冲磁场对微
17、生物灭活作用及其机理进行了研究，主要包括脉冲磁场对枯草芽孢杆菌的灭活效果，脉冲磁场对枯草芽孢杆菌细胞结构和功能的影响，初步探讨了灭活机理 10。3 研究目的及意义随着生活水平的提高，人们对食品的营养风味要求越来越高，传统的热杀菌方法已经不能满足人们对食品品质的需求。因此，非热杀菌技术成为研究的热点。在众多非热杀菌技术中，关于强磁场杀菌的理论研究最少，而且在这为数不多的研究中还出现了杀菌效果矛盾的现象。本文以 Hydropath technology 公司的 S38 型电子式水垢处理器为磁场产生装置，研究其对细菌、真菌及霉菌的杀灭作用，并初步探讨其灭菌机制。该装置体积小，可安装在家用自来水管道上
18、，若确实能起到其所宣传的除垢、防垢、杀菌、灭藻的作用，将大大提高家庭用水的清洁与安全。4 强磁场对微生物的杀灭效果4.1 仪器与试剂4.1.1 菌种大肠杆菌 Escherichia coli、酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae、黑曲霉 Aspergillus niger。4.1.2 仪器与设备S38 型磁场杀菌设备（Hydropath Technology LTD）、BT-600L 型智能蠕动泵、UV-2000 型紫外可见分光光度计、SPX-250B-Z 型生化培养箱、SW-CJ-2G 型双人净化工作台、MLS-3780 型高压蒸汽灭菌锅、电子天平、干燥箱、移液枪、培养
19、皿、烧杯、试剂瓶、量筒、离心管等。4.1.3 试剂营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、75%乙醇4.2 实验方法上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文54.2.1 实验准备（1）菌种培养称取 32 克营养琼脂培养基溶于 1000ml 超纯水中，称取 72 克孟加拉红培养基溶于2000ml 超纯水中，加热溶解后分装入试剂瓶中。将培养基、培养皿在灭菌锅中 121高压灭菌 15 分钟。在净化工作台中，将营养琼脂培养基约 15ml 倒入培养皿，待冷却后即成平板。将大肠杆菌菌种接种至培养基上，置于 37培养箱中培养 24 小时。同样的方法，将酿酒酵母和黑曲霉菌种接种至孟加拉红培养基上，置于室温分别培
20、养 3 天和 5 天。（2）样品菌液的配置从培养后的培养基基上取菌体，溶于无菌水中，大肠杆菌测 OD600 值，控制菌液浓度在 108-109CFU/ml，取 1ml 菌液于无菌离心管中备用。4.2.2 磁场杀菌蠕动泵流量设置为 1668.00ml/min、转速设置为 556.0rpm，将装样品菌液用的桶和软管用无菌水和 75%乙醇清洗，将蠕动泵软管穿过磁场发生装置，磁场杀菌设备接通电源即可使用，无法调节磁场强度。在桶中加入 10L 无菌水，取 1ml 作为空白对照。将准备好的 1ml 菌液稀释 100 倍后取1ml 加入 10L 无菌水中，混匀，使桶中菌液浓度为 105-106CFU/L。打
21、开蠕动泵使桶中的菌液来回通过磁场，分别取磁场处理前、通过 1 次磁场、通过 10 次、20 次、30 次、40 次、50 次（即 1 小时、2 小时、3 小时、4 小时、5 小时）磁场后的各 1ml。实验平行三次。4.2.3 杀菌效果的测定将磁场处理前后的菌液在净化工作台中，用涂布法进行平板接种，每个时间段的菌液做三个平行试验。大肠杆菌在 37培养箱中培养 24 小时、酿酒酵母和黑曲霉在室温下分别培养 3 天和 5 天后，分别用 GB 4789.38-2012 和 GB 478915-2010 中的方法进行菌落计数。4.3 结果与讨论上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文6图 1.磁场
22、处理前大肠杆菌数量 图 2.磁场处理后大肠杆菌数量图 3.磁场处理前酿酒酵母数量 图 4.磁场处理后酿酒酵母数量图 5.磁场处理前黑曲霉数量 图 6.磁场处理后黑曲霉数量磁场处理前和磁场处理 5 小时后菌液经再培养后情况如图 1-6 所示。计数后得大肠杆菌磁场处理 5 小时后的存活率约为 96/117=82.05%酿酒酵母和黑曲霉由于没有控制菌液浓度，培养后菌落数较多，无法计数。目测估计酿酒酵母的杀灭率同样很低，仅为 10%左右。而黑曲霉磁场处理后的数目反而增多，可能是由于接种时操作问题导致前序样品的孢子污染了后序样品。由以上结果可知，此磁场杀菌设备工作 5 小时对微生物的杀灭作用不大，其它时
23、间段的杀灭效果更差。上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文75 磁场对微生物形态和胞内物质的影响5.1 仪器与试剂5.1.1 菌种大肠杆菌 Escherichia coli、酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae、黑曲霉 Aspergillus niger。5.1.2 仪器与设备光学显微镜、载玻片、离心机、UV-2000 型紫外可见分光光度计、移液枪、烧杯、离心管5.1.3 试剂吕氏碱性美蓝染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、番红染液5.2 实验方法5.2.1 细胞形态的观察取磁场处理后的酵母菌菌液，加一滴在载玻片上，再加一滴吕氏美蓝染液，盖上盖玻片，放置 3 分钟后镜检
24、。5.2.2 微生物胞内生物大分子溢出物的测定取未处理和磁场处理 5 小时的三种菌液各 10ml 于离心机中 5000rpm 离心 15 分钟，取上清液分别在 260nm 和 280nm 处用紫外分光光度计测定吸光值，试验平行三次。5.3 结果与讨论5.3.1 磁场对微生物细胞形态的影响图 7.磁场处理后酿酒酵母形态（1040） 图 8.磁场处理后酿酒酵母形态（10100）光学显微镜观察到的磁场处理后酿酒酵母形态如图 7、8 所示，可见磁场处理后细胞表面仍然光滑，未见褶皱、破损、变形等现象，可能由于放大倍数不够。大部分细胞都被上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文8染成蓝色，说明大部分
25、细胞死亡或代谢缓慢，但再培养后仍然有大量菌落产生，说明大部分细胞经过磁场后只是代谢缓慢并未死亡。5.3.2 磁场对微生物胞内大分子溢出物的影响核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外 260nm 处有最大吸光值。蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外 280nm 处有最大吸收峰。磁场处理前后三种菌液在 260nm 和 280nm 处的吸光值如下表所示。表 1.磁场处理前后胞内生物大分子溢出物的吸光值OD260nm OD280nm菌种处理前 处理后 处理前 处理后大肠杆菌 0.088 0.104 0.089 0.101酿酒酵母 0.023 0.024 0.055 0.058黑
26、曲霉 0.037 0.045 0.027 0.039可见三种微生物磁场处理前后的 260nm 和 280nm 处吸光值均略有增加，但增加幅度很小，所以即使有胞内大分子溢出，其溢出量也不大，可能仅少量细胞破损死亡。6 结论与展望本实验所用的小型磁场杀菌装置并不能起到其所宣传的杀菌效果，虽然使用该装置杀菌 5 小时后对大肠杆菌和酵母菌产生了一定的杀灭效果，但效果不佳，远远不能达到家庭用水的要求。可能适当延长杀菌时间或改变水循环方式可增加其杀菌效果，有待进一步试验研究。增加该设备的磁场强度并将其改为脉冲磁场可能能够增加其灭菌效果，但脉冲磁场的设计较复杂，且多脉冲数会导致杀菌系统温度增加，所以改变磁场
27、类型成为今后研究的关键点。强磁场用于液体样品的灭活已有研究，但几乎没有涉及对固体食品的灭活研究，因此，可以把强磁场灭菌技术运用于固体食品灭菌的研究中，推动磁场灭菌技术的发展。参考文献1 徐怀德 王云阳. 食品杀菌新技术M. 科技文献出版社 , 2005.2 陈军. 食品杀菌技术概述J. 轻工科技, 2012(5):1-3.3 胡新宇,宁正祥.食品灭菌新技术J. 中国食品工业, 2000(12).4 樊伟伟 ,黄惠华 .微波杀菌技术在食品工业中的应用 J.食品与机械,2007, 23(1):143-147.5 李里特. 现代食品杀菌技术的原理与特点J. 食品与机械 , 1992(6):17-20
28、.上海大学生命科学学院 2013 级创新实践论文96 段振华. 现代高新灭菌技术及其在食品工业中的应用研究J. 中国食物与营养, 2006(9):28-30.7 Moore R L. Biological effects of magnetic fields: studies with microorganisms.J. Canadian Journal of Microbiology, 1979, 25(10):1145-1151.8 李梅, 曲久辉, 彭永臻. 脉冲磁场水处理技术在杀菌、灭藻方面的研究J. 环境科学学报, 2004, 24(2):260-264.9 马海乐, 高梦祥, 郭康权. 强脉冲磁场的杀菌效果及对食品品质的影响C.中国农业机械学会成立 40 周年庆典暨 2003 年学术年会论文集. 2003:82-85.10 钱静亚. 脉冲磁场对枯草芽孢杆菌的灭活作用及其机理研究D. 江苏大学, 2013.
