1、2013 年 6 月 1 日 第 6 期No6 1 June 2013中 医 学 报CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE第 28 卷 总第 181 期Vol28 Serial No181* 基金项目 : 河南省高校杰出科研人才创新工程(编号:2005KYCX006); 郑州市科技领军人才项目 ( 编号:121PLJRC534)丹参 、地西泮联合应用对焦虑小鼠的影响*Effect of the Combination Application of Salvia Miltiorrhiza and Diazepam on Anxiety in Mice张志娟Zhang
2、Zhijuan，郭花玲Guo Hualing，崔瑛Cui Ying，王君明Wang Junming，冯志毅Feng Zhiyi，冯静Feng Jing河南中医学院，河南郑州 450046Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou Henan China 450046摘要 : 目的:探讨丹参、地西泮联合应用对小鼠的抗焦虑作用及其作用机制。方法:将雄性小鼠随机分成7 组，分别为模型组，地西泮高、中、低剂量组，丹参地西泮高、中、低剂量组。模型组灌胃05%CMC-Na，其他组灌胃相应药物，连续给药5 d。末次给药05 h后，记录
3、小鼠进入开臂的次数占总入臂次数的百分比( OE%)及在开臂中滞留的时间占总入臂时间的百分比( OT%)。明暗箱实验记录小鼠10 min内在明暗箱中的穿箱次数。观察丹参、地西泮联合应用对小鼠焦虑的干预作用。用酶免法测定小鼠脑内-氨基丁酸，谷氨酸，5-羟色胺的含量。结果:丹参地西泮高剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫OE%、OT%，显示出对小鼠的抗焦虑作用。丹参地西泮中剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫OT%和小鼠明暗穿箱次数，二者联用有协同增效的趋势。结论:丹参、地西泮联合使用有增加抗焦虑作用的趋势，其抗焦虑机制可能与能降低小鼠脑内的GLu含量有关。文献引用 : 张志娟，郭花玲，崔瑛，等丹参
4、、地西泮联合应用对焦虑小鼠的影响J中医学报，2013，28(6):854 856Abstract:Objective:To explore the anti-anxiety effect and its mechanism of the combined application of salvia miltiorrhiza and diaze-pam on anxiety in mice Methods:The male mice were randomly divided into 7 groups，respectively，the model group，the high，medium，l
5、ow doses of diazepam group，salvia miltiorrhiza and diazepam in high，medium，low dose group The model group was given intragastricadministration of 05%CMC-Na and other groups were treated with intragastric administration of the corresponding drugs，continuous in-tragastric administration for 5 days Hal
6、f an hour after the last administration，recorded the mice open-arms entries accounting for thepercentage of the total entry arms numbers( OE%) and open-arms time accounting for the percentage of the total entry arms time( OT%) The numbers of mice passing the box in 10 minutes were recorded by the li
7、ght-dark box experiment The intervention effect ofthe combined application of salvia miltiorrhiza and diazepam on anxiety in mice was observed，and the content of -aminobutyric acid，glutamic acid and 5-HT neurotransmitter in brain of mouse were determined by enzyme-linked immunosorbent assay method R
8、esults:The high-dose group of the combination of salvia miltiorrhiza and diazepam could significantly increase the percentage of stay numbersand time entering open arms in the elevated plus maze test，showing the anti-anxiety effects on mice And the medium dose group couldsignificantly increase the p
9、ercentage of stay time entering open arms in the elevated plus maze test and the passing times in the light-dark transitions test，showing a synergistic trend of the combined application of salvia miltiorrhiza and diazepam Conclusion:The combi-nation of salvia miltiorrhiza and diazepam has a trend of
10、 increasing the anti-anxiety effect，and its anti-anxiety mechanism may be relatedto reduce the GLu content of mouse brainReference citation:Zhang Zhijuan，Guo Hualing，Cui Ying，et al Effect of the Combination Application of Salvia Miltiorrhiza and Diaze-pam on Anxiety in MiceJ China Journal of Chinese
11、 Medicine，2013，28(6):854 856关键词 : 丹参;地西泮;抗焦虑;谷氨酸;酶联免疫法;小鼠Key words:salvia miltiorrhiza;diazepam;anti-anxiety;glutamate;enzyme-linked immunosorbent assay;rat中图分类号 CLC number: R2855 文献标志码 Document code: A 文章编号 Article ID: 1674 8999( 2013) 06 0854 03丹参为唇形科植物丹参 ( Salvia miltiorrhiza Bge ) 的根 。始载于 神农本草经
12、， 列为上品 ， 味苦 ， 性微寒 。入心 、肝经 ，具有活血祛瘀 ， 凉血消痈 、止痛 、清心除烦等多种功能 ， 主治瘀血所致月经不调 、痛经 、经闭 、血崩带下 、瘀血腹痛 、骨节疼痛 、惊悸不眠 、恶疮肿毒 1。丹参有清心除烦之功 ， 药理研究显示其对实验小鼠有明显镇静作用 2， 丹参酮对中枢神经具有镇静作用 ， 是地西泮受体的部分激动剂 3， 提示丹参在抗焦虑应用上可能与地西泮有协同作用 。因此 ， 开展丹参与地西泮的联合用药研究 。4582013 年 6 月 1 日 第 6 期No6 1 June 2013中 医 学 报CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICIN
13、E第 28 卷 总第 181 期Vol28 Serial No1811 材料与方法11 仪器高架十字迷宫 ( EPM) ( 成都泰盟科技有限公司 ， 批号 :20050228) ; 明暗箱 手工制作 ， 一箱为明室 ( 15 cm 10 cm 20 cm) ， 另一箱为暗室 ( 25 cm 10 cm 20 cm) ， 两室有一圆形孔相通 ; 戴安高效液相色谱仪 -荧光检测 ( RF2000 型 ) ;AE240 十万分之一分析天平 ( 瑞士梅特勒仪器有限公司 ) ;JY6002 型电子天平 ( 上海精科公司天平仪器厂 ) ; RE-52AA型旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ; 3-1
14、8K 冷冻离心机( 德国 Sigma 仪器有限公司 ) ; DY89-1 型电动玻璃匀浆机 ( 宁波新芝生物科技有限公司 ) ; 可调式移液器 ( 上海雷勃分析仪器有限公司 ) ; PT2100 组织捣碎匀浆机 ( 瑞士 KINEMATICA公司 ) ; 酶免仪 ( 680 Microplate Reader， Bio-Rad Laboratories) 。12 试药丹参 : 购于郑州市本草国药馆 ， 产 地 : 山 东 ; 批 号 :090916， 经河南中医学院教授陈随清鉴定确认为丹参正品 。质量标准符合 中华人民共和国药典 2010 年版要求 。地西泮 : 天津力生制药股份有限公司 ，
15、批号 : 0901001。谷氨酸检测试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所生产 ， 批号 : 20110214) ;-氨基丁酸检测试剂盒 ( RD 生产 ， 批号 : 20110216) ; 5-氢基色胺检测试剂盒 ( RD 生产 ， 批号 : 20110216) ; 氯化钠注射液 ( 郑州永和制药有限公司 ， 批号 : 10073108) ， 其他试剂均为分析纯 ， 水为双蒸水 。13 动物SPF 级雄性昆明种小鼠 84 只 ， 体质量 18 22 g， 购自郑州大学医学院实验动物中心 ， 合格证号 SCXK( 豫 ) 2011-0001。14 方法141 丹参干浸膏的制备 取丹参 80 g，
16、以 8 倍量水冷浸30 min， 加热提取两次 ， 每次 1 5 h， 合并两次提取液 ， 抽滤除杂 ， 减压浓缩至少量 ， 水浴加热至稠膏状 ， 然后真空干燥至恒质量 ( 60 ) ， 得丹参干浸膏 ， 冰箱冷藏 ( 4 ) 保存备用 。142 分组与给药 雄性小鼠 84 只 ， 体质量 18 22 g， 不限食水饲养 3 d， 随机分成 7 组 ， 每组 12 只 ， 分别为模型组 ， 地西泮高 、中 、低组 ， 丹参地西泮高 、中 、低剂量组 ， 参考前期实验结果 ， 此次实验模型组给予 0 5% CMC-Na 混悬液 ; 地西泮高 、中 、低剂量组分别给予 2 5 mgkg1， 1 2
17、5 mgkg1，0. 625 mgkg1地西泮混悬液 ; 丹参地西泮高 、中 、低剂量组分别给予丹参地西泮混合溶液 ( 790 +25) mgkg1，( 395 +1 25) mgkg1，( 198 +0625) mgkg1。室温保持在 20 左右 ， 保持安静 。灌胃体积 10 mLkg1， 连续灌胃 5 d。末次给药 05 h 后依次进行小鼠高架十字迷宫实验和明暗箱实验 。高架十字迷宫实验记录小鼠 5 min 内进入开臂的次数占总入臂次数的百分比 ( OE%) 及在开臂中滞留的时间占总入臂时间的百分比 ( OT%) 。明暗箱实验记录小鼠 10 min 内在明暗箱中的穿箱次数 4。143 小
18、鼠脑组织的处理 小鼠行为学实验结束后 ， 断头处死 。在冰台上迅速剥离大脑 。沿矢状缝切成左右半球 。在液氮中保存左脑 ， 测定 -氨基丁酸 ( GABA) 、谷氨酸 ( GLu) 和 5-氢羟色胺 ( 5-HT) 的含量 。测定前用分析天平称其质量 ， 根据此质量计算应加入的冰冷的生理盐水的量 ， 以脑组织 ( g) : 生理盐水 ( mL) = 19 的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆 。4 ， 3 000 rmin 1离心20 min。取上清液于 20 以下低温保存 。制成 10% 的脑匀浆按测试盒说明操作 ， 分别测定脑组织中 GABA、Glu和 5-HT 的含量 。15 统计学方法采
19、用 SPSS 170 统计学软件对结果进行单因素方差分析 。所有数据以均数 标准差 ( 珋x s) 表示 ， 组间比较采用 t检验 ， P 005 为差异有统计学意义 。2 结果21 对小鼠高架十字迷宫及明暗箱行为的影响与模型组比较 ， 地西泮高剂量组能显著增加小鼠明暗穿箱次数 ， 地西泮低剂量组既能显著增加小鼠进入高架十字迷宫 OT%， 也能增加小鼠明暗穿箱次数 。丹参地西泮高剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫 OE%、OT%; 丹参地西泮中剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫 OT% 和小鼠明暗穿箱次数 ; 丹参地西泮低剂量组对小鼠高架十字迷宫和明暗箱焦虑行为无显著性改善 。见表 1。表
20、 1 对小鼠高架十字迷宫和明暗箱穿箱行为的影响( 珋x s， n =12)组别 剂量 ( mgkg1) OT( /%) OE( /%) 穿箱次数 ( 次 )模型组 32 58 6 21 36 50 8 31 23 75 11 18地西泮高组 2 5 36 08 11 34 32 17 12 58 36 75 7 84*地西泮中组 1 25 39 00 10 56 36 17 11 79 33 25 10 53地西泮低组 0 625 44 50 11 07*43 67 10 48 36 0 17 95*丹参地西泮高剂量组 790 +2 5 55 83 7 97*49 25 15 55*34 33
21、 12 58丹参地西泮中剂量组 395 +1 25 42 08 16 02*44 42 14 45 41 92 18 39*丹参地西泮低剂量组 198 +0 625 39 42 15 10 37 50 13 89 29 58 10 58注 : 与模型组比较 ， * P 00522 对小鼠脑内 Glu、GABA 和 5-HT 含量的影响与模型组比较 ， 地西泮低剂量组能显著降低小鼠脑内GLu 的含量 ( P 005) 。丹参地西泮中剂量组能显著降低小鼠脑内 GLu 的含量 ( P 0 05) 并能显著降低 Glu/GABA 的比值 ( P 005) 。各组小鼠脑内 5-HT 含量无明显差异 。见
22、表 2、表 3。5582013 年 6 月 1 日 第 6 期No6 1 June 2013中 医 学 报CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE第 28 卷 总第 181 期Vol28 Serial No181表 2 对小鼠脑内 Glu 和 GABA 含量的影响( 珋x s， n =12)组别剂量( mgkg1)Glu( c/molL1)GABA( c/molL1)Glu/GABA模型组 5 42 2 78 0 93 0 18 5 83 1 36地西泮高组 2 5 5 16 1 75 0 80 0 14*6 45 0 90地西泮中组 1 25 5 20 2 81 0
23、 85 0 19 6 18 1 85地西泮低组 0 625 4 04 1 98*0 97 0 17 5 09 0 88丹参地西泮高剂量组 790 +2 5 6 57 1 47 0 89 0 12 7 38 0 95丹参地西泮中剂量组 395 +1 25 3 39 2 22*0 91 0 11 3 73 1 26*丹参地西泮低剂量组 198 +0 625 6 32 2 19 0 92 0 13 6 87 1 38注 : 与模型组比较 ， * P 005表 3 小鼠脑内 5-HT 含量的影响 ( 珋x s， n =12)组别 剂量 ( mgkg1) 5-HT( /ngL1)模型组 25 71 4
24、36地西泮高组 2 5 27 15 3 78地西泮中组 1 25 26 34 4 45地西泮低组 0 625 26 78 3 44丹参地西泮高剂量组 790 +2 5 26 24 3 98丹参地西泮中剂量组 395 +1 25 26 19 3 58丹参地西泮低剂量组 198 +0 625 25 05 3 15注 : 与模型组比较 ， * P 0053 讨论实验选择经典的高架十字迷宫和明暗箱装置 ， 成功复制了小鼠焦虑模型 。地西泮组在一定程度上改善了模型动物高架十字迷宫中开臂 、闭臂中停留的时间百分比 ( OT%) ， 和明暗箱中的穿梭次数 ， 造模成功 。丹参地西泮高剂量组与地西泮高剂量比较
25、 ， 虽然穿箱次数改善不佳 ， 但在高架十字迷宫的开臂 、闭臂中停留的时间百分比 ( OT%) 和次数百分比 ( OE%) 均有显著改善 ( P 0. 05) ; 地西泮加丹参中剂量组与地西泮中剂量比较 ， 在高架十字迷宫的开臂 、闭臂中停留的时间百分比 ( OT%) 和穿箱次数都有显著改善 ( P 0 05) ; 表现出协同增效作用 。而丹参地西泮低剂量组与地西泮高剂量比较 ， 没有表现出增效作用 。焦虑症发病机制主要有神经递质假说和神经内分泌功能紊乱假说 ， 前者主要包括 5-羟色胺 ( 5-HT) 系统功能亢进 、去甲肾上腺素 ( NE) 系统功能亢进 ， -氨基丁酸功能不足等 ;后者主
26、要有下丘脑 -垂体 -肾上腺 ( HPA) 轴 、下丘脑 -垂体 -性腺 ( HPG) 轴活动异常 5。现代研究证实 ， 与焦虑症有关的神经递质主要为 -氨基丁酸 ( GABA) 、5-羟色胺 ( 5-HT) 、去甲肾上腺素 ( NE) 和多巴胺 ( DA) 四大类神经递质 ， 神经递质之间的失衡是焦虑症发病的重要机制之一 6。通过实验观察到 ， 丹参地西泮联合应用能显著降低小鼠脑内 GLu 的含量 ，能显著降低 Glu/GABA 的比值 ， 其抗焦虑机制可能与能降低小鼠脑内的 GLu 含量有关 。尤其是丹参与地西泮中剂量组表现最为突出 。实验结果认为 ， 丹参地西泮高剂量 、中剂量联合应用
27、， 有协同增效作用 。尤其是中剂量组 ， 不仅能同时改善高架十字迷宫和明暗箱两种焦虑模型的焦虑行为 ， 而且对中枢 Glu 递质有明显的抑制作用 ， 可使 Glu/GABA 的比值显著降低 。有必要进一步深入研究 。参考文献 : 1 张兴国 丹参品种资源特性的研究 J 中草药 ， 2002， 33( 8) :742 747 2 陈昌钦 丹参注射液用于兴奋躁动患者的辅助治疗 J 华夏医学 ， 2002， 15( 2) : 166 3 Wang， N ， Luo， H W ， Niwa， M ， et al A new platelet aggregationinhibitor from Salv
28、ia miltiorrhiza J Planta Med， 1989， 55 ( 4) :390 391 4 刘惠芬 ， 周文华 焦虑的生物学机制 J 中国药物滥用防治杂志 ， 2000， 6( 6) : 19 5 崔瑛 ， 冯静 ， 王辉 ， 等 熟地黄干预小鼠焦虑行为实验 J 中国临床康复 ， 2006， 43( 10) : 63 6 王欣君 针药结合抗抑郁快速起效的中枢 5-HT 受体机制及临床研究 D 南京 : 南京中医药大学 ， 2009: 82收稿日期 : 2013 01 23作者简介 : 张志娟(1982 )，女，河南辉县人，硕士研究生，中药师，研究方向:中药抗焦虑研究。通信作者
29、 : 崔瑛(1961 )，男，医学博士，教授，研究方向:中药抗焦虑研究。Email:cyexin126 com编辑:檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏魏丹丹中医学报 采编平台作者投稿系统正式开通中医学报已于2012 年3 月27 日正式开通运行采编平台作者投稿系统，作者可注册登录中医学报网址投稿:http: / /zyx cbpt cnki netwww zyxb cn www zhzyxb com若为基金论文请将基金项目名称、编号附上。将中英文摘要按目的、方法、结果、结论方式撰写。并请附第一作者和通信作者简介，格式如下:姓名(出生年)，性别，民族，籍贯，学历，学位，职称，现从事工作或研究方向以及学术团体兼职，电子邮箱，联系电话。若有问题可打电话:0371 65962973，0371 65676818或发电子邮件至:ctcm hactcm edu cn或ctcm chinajournal cn咨询。对您的大力支持，本刊深表谢意。中医学报编辑部658
