1、第一章 蛋白质 (Proteins),什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分,根据蛋白质形状,每克样品中所含蛋白质的克数= 每克样品中的含氮量（克） 6.25,蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的
2、45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,一、蛋白质的基本组成单位氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸
3、 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,目 录,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine
4、 Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,目 录,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,目 录,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,（二）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectri
5、c point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm吸光值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3. 茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,茚三酮反应(n
6、inhydrin reaction),茚三酮 氨基酸 茚三酮(还原型) 醛,茚三酮 蓝色或紫色化合物,2,二、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式 肽键,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(p
7、olypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,蛋白质的分子结构包括 ： 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(t
8、ertiary structure) 四级结构(quaternary structure),第二节 蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein,定义 蛋白质的一级结构（primary structure）是指蛋白质分子中多肽链的氨基酸排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,目 录,测序前的准备N端分析以确定蛋白质的多肽链数目断裂二硫键分离单一多肽链测定多肽链的氨基酸组成 多肽链氨基末端与羧基末端分析二硝基氟苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene
9、）法丹酰氯 (dansyl chloride)法 多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合对多肽链进行限制性水解成小片段Edman降解法进行小片段肽段的序列分析对各片段序列进行比较叠加，拼出完整的多肽序列,（二）多肽链的氨基酸序列分析(自学),二、蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,定义,主要的化学键： 氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,蛋
10、白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet )-转角 ( -turn )无规卷曲 ( random coil ),（二） -螺旋,目 录,-螺旋的基本要点,1.右手螺旋； 2.每3.6氨基酸上升一个螺旋,螺距为0.54 nm,每个氨基酸上升0.15 nm； 3.螺旋的稳定靠氢键； 4.甘氨酸和组氨酸不能形成-螺旋,（三）-折叠,（四）-转角和无规卷曲,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,-螺旋,-转角,HTH模体结构示意图 螺旋-转角-螺旋模体由2个螺旋和1个转角组成。HTH模体是DNA结合蛋白三维结构中的一部分，每一
11、DNA结合蛋白含一个HTH模体，位于分子表面。DNA结合蛋白常以二聚体形式存在，两个HTG模体相距3.4nm，与DNA的螺距相当，分别结合于DNA分子中相邻的两个深沟中。HTH模体约由20个氨基酸残基组成，第1个螺旋含7个氨基酸残基， 转角含4个氨基酸残基，第2个螺旋含9个氨基酸残基。第2个螺旋是DNA识别部位，结合于DNA分子的深沟中。,螺旋,螺旋,转角,N,C,模体：在许多蛋白质的分 子中，常发现几个（多为 23个）具有二级结构的 肽段相互靠近，形成具有 特定功能的空间构象；或 者仅是一个具有特定功能 的很短的肽段。,模体（motif）,三、蛋白质的三级结构,疏水键、离子键、氢键和 Van
12、 der Waals力等。,主要的化学键,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义,目 录,肌红蛋白 (Mb),（三）蛋白质的四级结构,含有两条以上具有独立三级结构的多肽链的蛋白质，其多肽链通过非共价键相互连接形成的多聚体结构。每个具有独立三级结构的多肽链程为亚基。蛋白质四级结构是蛋白质分子中各亚基之间的空间排布。稳定蛋白质四级结构的化学键是氢键、离子键、疏水作用和Van der Waals力等次级键。,三、胶原蛋白的分子结构,胶原蛋白(collagen) 简称胶原，是纤维状蛋白质，主要存在于细胞外基质。胶原分子又称原胶原 （tropocollage
13、n），是富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨 酸的三股螺旋结构。胶原分子一级结构特点：富含甘氨酸和脯氨酸 和羟脯氨酸，存在长段的由三个氨基酸组成 的重复 顺序： 甘-脯-Y或甘-X-脯（X和Y代表任何氨基酸）。,某些组织中胶原蛋白的含量,组 织 含 量,骨（矿物质除外） 88.0 跟腱 86.0 皮肤 71.9 角膜 68.1 软骨 4663 韧带 17.0 主动脉 12 24 肝 3.9,胶原蛋白简称胶原，主要存在于细胞外基质，是体内含量最多的蛋白 质，约占人体蛋白总量的2530%。胶原具有柔韧性和抗张力作用，在组织 中构成框架，增强组织的强度和韧性。胶原是结缔组织的主要蛋白成分， 在一些组织中含量非
14、常高 。,胶原分子结构示意图 胶原分子是由三条多肽链组成的三股右手螺旋。第一条多肽链均为左手螺旋，每3个氨基酸残基螺旋上升一周。多肽链中富含甘氨酸和脯氨酸（羟脯氨酸），形成 甘-脯-Y或甘-X-羟脯重复序列。三股螺旋中，甘氨酸的R基团位于分子内部，并与邻近的肽链形成链间氢键。此外，胶原分子内部链间与胶原分子之间还有赖氨酸残基之间形成的共价键，以维系胶原蛋白的稳定性。,（二）胶原分子的空间结构,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然
15、状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间结构与功能的关系,目 录,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白的三级结构含有8个-螺旋，分别取名为A、B、C、D、E、F、G、H。血红素位于E和F之间，F8组93
16、(绿色)与Fe形成第5个配位键。,A,B,C,D,E,F,G,H,93,64,肌红蛋白与血红蛋白的带氧曲线 肌红蛋白的氧饱和曲线为距形双曲线,血氧饱和度为20%时仍能带氧,肌肉 缺氧时(氧饱和度为5%)大量释放氧,以供肌肉收缩需要;血红蛋白的氧饱和曲线 为S形曲线,表明血红蛋白四个亚基对氧的结合具有正协同效应。,血红素与氧结合模示图,（三）朊病毒与蛋白质构象病,朊病毒蛋白（prion protein, PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由螺旋变成折叠所致。朊病毒本身不能自我复制，但可以
17、攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。,正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构的差异朊病毒（PrPsc）是蛋白质，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间 构象由-螺旋变成-片层结构所致。因此，这类疾病又称蛋白质构象病。朊病毒 本身不能复制，但它却可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变， 并与其结合，成为致病的朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常的朊病毒蛋白。这 样，脑组织中的朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性变。,正常朊病毒蛋白结构（显示-螺旋）,朊
18、病毒结构 （显示-片层结构）,蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳 定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。,水化膜,正电荷,H+,OH-,OH-,H+,蛋白质,在等电点时的亲水胶体,带负电荷的亲水胶体,蛋白质,蛋白质,带正电荷的亲水胶体,负电荷,第四节 蛋白质的理化性质及其提取、纯化原理,1. 蛋白质的两性解离,一、蛋白质的理化性质,2、蛋白质的变性与复性,变性是指蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。,双缩脲反
19、应（biuret test）：碱性条件下，Cu2+ 与蛋白质分子中的肽键形成紫红色络合物酚试剂呈色反应（Lowry test）：除蛋白质分子中肽键与碱性Cu2+发生二缩脲反应外，蛋 白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化合物（钼蓝）,3. 蛋白质的胶体性质亲水胶体, 分子直径1100nm4. 蛋白质的光谱吸收色氨酸与酪氨酸残基含共轭双键，280 nm紫外 光下有吸收峰5. 蛋白质的呈色反应,二、蛋白质的提取与纯化原理,（一）改变蛋白质的溶解度,盐析：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出,有机溶剂沉淀：降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间相互吸引而沉淀,（二）根据蛋白
20、质分子大小分离方法,离心(centrifugation)：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质进行分离根据转速分类：常用离心机 50 000 rpm,超滤（ultrafiltration）:在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的 超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被 截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化 蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。,磁力搅拌器,待超滤的蛋白质溶液,加压的氮气,超滤膜,凝胶过滤（gel filtration）：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的 微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部 后，小分子物质通过胶
21、粒的微孔进入胶粒，向下流动的 路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒 内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短， 移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分 分开的目的,根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。常用的方法有：离子交换层析电泳等电聚焦。,（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法,第五节 蛋白质组(proteome) 与蛋白质组学(proteomics),蛋白质组：一个组织或一个细胞中基因组所表达的全部蛋白质，或在特定条件下，一个细胞内所存 在的所有蛋白质.,蛋白质组与基因组的差别：基因组：代表一个生物细胞内的全部基因和染
22、色体的核苷酸组成。同一个体的所有体细胞均具有均一的基因组，不受机体状态的影响。,蛋白质组：不能从基因组简单地推导出一个细胞的蛋白质组组成，这是 因为：细胞不是对所有的基因同时表达；表达的基因因为表达的 mRNA不同，可以翻译出不同的蛋白质；同一蛋白质前体经不同的剪接表现出不同的蛋白质；同一种蛋白质在不同的代谢调节条件下可以表现出不同的构象和不同的修饰。同一个体的不同发育期中因基因的开关，同一组织或细胞中的蛋白质组组成不同；同一生长时期的不同组织器官的细胞中基因表达不同，产生具有不同的蛋白质组；不同的生理状况（饱食、禁食、应激等）不同的基因表达出不同的蛋白质组组成；不同的病理（肿瘤、炎症等）条件
23、下不同的基因开放而表达出不同的蛋白质组；环境因素（药物等）均可影响细胞内蛋白质组的组成。所以，组织器官的蛋白质组具有多样性、多变性和可调节性，具有不同时、空的差异和深受机体内、外条件的影响。,蛋白质组学研究和阐述在不同条件下，蛋白质组中全部蛋白质的结构、性质与功能，影响因素及其相互联系。,某种生理功能的蛋白质组学（functional proteomics） 结构蛋白质组学(structural proteomics) 亚细胞结构的蛋白质组学(subcellular proteomics) 各种疾病的蛋白质组学（disease proteomics） 等等,在桑格工作的基础上，许多科学家试图人
24、工合成胰岛素。当时由 于不能拆开的胰岛素的二条链再连接起来，许多人放弃了这一计划。 1959年，在中国国家科委的组织领导下，北京大学化学系、中国科学 院生物化学研究所和上海有机化学研究所钮经义、王应睐、龚岳亭、 邹承鲁、杜雨苍、季爱雪、邢其毅、汪猷等科学家共同开始了人工合 成胰岛素的研究。1965年终于人工合成了牛胰岛素结晶。经鉴定，人 工合成的牛结晶胰岛素在结构、理化性质、结晶形状、生物活性等方 面都与天然的胰岛素无异。同年，诺贝尔委员会主席来中国考察授奖 事宜，使人为难的是，诺贝尔奖规定授奖对象不能超过三人，而中国 从事此项工作的主要骨干就有 二十余人。这使这项在世界上 引人瞩目的伟大成就与诺贝尔 奖擦肩而过。但无论如何，中 国在人工合成蛋白质方面走在 了世界的最前头。,蛋白质的基本组成单位是什么? 什么是肽键?肽键平面?肽单位? 什么是蛋白质的一级结构?二级结构?三级结构?维持这些结构的作用力各是什么?二级结构的基本形式有哪些?a-螺旋的基本要点有哪些? 什么是蛋白质的四级结构?所有的蛋白质都有四级结构吗? 蛋白质的基为本性质有哪些?什么是蛋白质的等电点PI ?什么是蛋白质的两性解离性质? 何谓蛋白质的变性和复性? 引起蛋白质溶于水的因素有哪些?变性的蛋白质一定沉淀吗?沉淀的蛋白质一定变性吗?举例说明.,思考题,
