1、,实验三,线粒体和细胞核的制备与观察,细胞生物学实验,差速离心技术 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性.线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色.詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色 .Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。,通过对动物细胞核及线粒体的分离,掌握差速离心技术.掌握细胞核及线粒体活性鉴定.,材料：大白鼠肝脏,试剂0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tr
2、is)-盐酸缓冲液(pH7.4) 0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4） 1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 姬姆萨染液（Giemsa） 卡诺（Carnoy）固定液生理盐水 仪器：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机等,细胞器的分离,鼠肝0.5-1克洗去血液加预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆(9ml,分次加) 双层尼龙布过滤滤液(制一张涂片,自然干燥),将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖缓冲液上,700g离心10min,沉淀（细胞核及碎片）,上清液1(制一张涂片,自然干燥),洗
3、涤（0.25mol/L预冷蔗糖缓冲液5mL洗涤两次）每次1000g 离心15min,沉淀（细胞核）制一张涂片,上清液2(与上清液1合并)混合上清液,细胞器的分离,混合上清液10000g离心10 min,沉淀（线粒体）,上清液3（弃去）,洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖缓冲液10mL洗涤两次）每次10000g 离心10min,沉淀（线粒体）制一张涂片A,上清液4制一张涂片B,分离物鉴定 细胞核:将干燥后的三张涂片(涂片 )加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40）检查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。线粒体：取线
4、粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状.注意上清液4制备的涂片B有何不同,分离物鉴定,细胞核的鉴定涂片干燥卡诺固定15min 干燥,Giemsa染色10min漂洗干燥镜检1040细胞核呈紫红色细胞质为浅蓝色,线粒体的鉴定在载玻片上滴一滴Janus green B 牙签挑取少许沉淀染色1030min盖上玻片镜检1040,换油镜线粒体呈蓝绿色,试验全过程要在04进行,离心机温度设为4 尽可能充分破碎组织(适度研磨)，缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。g为离心力(RCF)RCF(g)=1.11810-5 r (rpm)2
5、r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分)离心机使用：离心管要平衡,1.分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)2.描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的纯度如何?,离心分离技术,离心分离细胞组分和生物分子是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。,离心分离技术,速度离心velocity centrifugation差速离心(differential centrifugation)移动区带离心(moving-zone centrifuga
6、tion)如蔗糖密度梯度离心等密度离心isodensity centrifugation,差速离心,主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。,移动区带离心,这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。在此方法中，分离介质对被分离的物质必须是中性无害的，并且密度
7、梯度较低，底部的密度比管顶部的密度大，建立密度梯度的目的是防止扩散。重要的是，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大。常用的是蔗糖密度梯度离心(sucrose density gradient centrifugation)。,移动区带离心分离,等密度离心,等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度， 这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的惟一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1%
8、 就可用此法分离。蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区带离心中梯度原理是不同的，在移动区带离心中梯度的惟一目的是减少样品的扩散， 即使是在离心管的底部，颗粒的密度也比介质大。相反，在等密度梯度离心中，使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:1.65g/ cm3，底部为:1.75g/ cm3。因为DNA的密度是1.70g/ cm3，会停留在离心管的中部。,密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体,CsCl 密度梯度离心分离DNA,
