1、 薄层层析通用显色剂1 通用试剂(1) 重络酸钾-硫酸:检 查一般有机物.喷洒剂:5 克重络酸钾溶于 100 毫升 40%硫酸中.薄层检查:喷洒后加 热到 150至班点出现(2) 荧光素-溴:检查不饱和化合物喷洒剂:0.1 克荧光素溶于 100 毫升乙醇中溴试剂:5%的溴的四氯 化碳溶液喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物 ,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.(3) 碘:检查一般有机物.方法:a 层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合
2、物呈棕色斑点。b 层析谱放碘蒸气中 5 分钟（或喷 5碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷 1淀 粉的水溶液，斑点转成蓝色。(4)硫酸：通用喷洒剂：5的浓硫酸乙醇溶液，或 15浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸醋酸（1：1）喷洒后处理：空气中干燥 15 分钟，再热至 110直至出现颜色或荧光。(5)硝酸银氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：检查还原性物质。溶液 I : 0.1%N 硝酸银; 溶液 II: 5N 氢氧化铵喷洒剂: I 和 II 以 1:5 混合 (临用前混合)喷洒后处理: 105加热 510 分钟,至深黑色斑点出现 .(6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原
3、性物质,类脂体,生物碱, 甾体喷洒剂: 510%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液喷洒后处理: 120 加热至斑点出现.沉淀试剂: 1 克硅钨酸溶于 20 毫升水中,加 10%盐酸至强碱性.2 生物碱(7)硫酸: 检查生物碱及含碘化合物喷洒剂: 0.1 克硫酸?混悬于 4 毫升水中,加入 1 克三氯醋酸,加热至沸, 逐滴加入浓硫酸至澄清.喷洒后处理: 110加热数分钟至斑点出现.(8)碘化铋钾(Drage ndorff)试剂:检查生物碱及其他 含氟化合物.溶液 I: 0.85 克次硝酸铋溶于 10 毫升冰醋酸 40 毫升水中溶剂 II: 8 克碘化钾溶于 20 毫升水中.制备液 I+II,等体积
4、混合. 可用于棕色瓶中保存较长时间 ,一般制备液可作沉淀试剂用.喷洒液: 制备液 1 毫升与 2 毫升醋酸,10 毫升水混合即得(9).碘化汞钾(Mayer)试剂: 检查生物碱.制备液: 13.55 克氯化汞和 49.8 克碘化钾各溶于 20 毫升水中,等体积混合并用水稀释至 1000 毫升.喷洒液: 制备液加 1/10 体积的 17%盐酸.喷洒后处理: 观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.(10) ?酸纳- 浓硫酸(Mandelin)试剂:检查生物碱.1%酸纳的 浓硫酸溶液 .与 多种生物碱呈不同颜色.(11)碘碘化钾(Wagner) 试剂:检查生物碱.1 克碘及 10 克碘化钾,溶于 5
5、0 毫升水中,加热,加 2 毫升醋酸,再用水稀释至 100毫升.可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.3 酚类,鞣质(12)三氯化铁: 检查酚类及 ?酸.喷洒剂:15%三氯化 铁的水溶液或乙醇溶液 .并加盐酸少许.?酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.(13)铁氰化钾-三氯化钾:检查酚类,芳香胺类及还原性物质.喷洒剂: 1%铁氰化钾水溶液,2% 三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.喷洒后处理: 喷洒后 酚性物质呈蓝色斑点.再喷 2N 盐酸,能使颜色加深, 纸谱可用稀盐酸洗去喷洒液.(14) 4-胺基安替比林- 铁氰化钾(Emerson 反应): 检查酚类 .喷洒剂: I . 2%4-氨基安替比林乙醇
6、溶液;II. 8%铁氰化钾水溶液 .或用 0.9%4-氨基安替比林和 5.4%铁氰化钾水溶液方法: 先喷洒 I,再喷洒 II,即显色,或再放入密闭缸中, 缸内放 25%氢氧化铵, 即产生橙色至深红色.(15) 对氨基苯磺酸, 重氮盐 (Pauly 试剂): 检查酚类, 芳香胺类及能偶合的杂环化合物.喷洒剂: 4.5 克对氨基苯磺酸,加热溶于 45 毫升 12N 盐酸中,用水稀释至 500 毫升,取 10 毫升稀释液用冰冷却,加 10 毫升冷 4.5%亚硝酸钠水溶液,0放 15 分钟(此试剂于 0可保存 3 天), 用前加等体积 1%碳酸钠水溶液 .一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.(
7、16) 对甲苯磺酸: 检查甾体 ,黄酮,鞣质.喷洒剂: 20%对甲苯磺酸氯仿溶液.喷洒后处理: 100加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.4 含氧杂环及蒽醌类 *(17) 三氯化铝: 检查黄酮体 .喷洒 1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光(18)碱式醋酸铅: 检查黄酮体 .喷洒剂: 饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液.于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.(19)醋酸镁: 检查蒽醌甙, 甙元及黄酮体喷洒剂: 0.5%醋酸镁甲醇溶液方法: 90加热 5 分钟,呈红色至紫色斑点.(20)氢氧化钾: 检查香豆素 ,蒽醌甙及甙元喷洒剂: 510%氢氧化钾的甲醇溶液.于日光及紫外线
8、荧光分析灯下检示斑点.5 萜类,甾体(21) 三氯化锑(Carr-Price 试剂): 检查甾体,萜类,皂类.喷洒剂: 25 克三氯化锑溶于 75 克氯仿中(亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液).喷洒后处理: 100 加热 5 分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.(22) 五氯化锑: 检查甾体 ,萜类,皂甙.喷洒剂: 五氯化锑-氯仿或四氯化碳(1:4),用前新鲜配制.喷洒后处理: 120加热至斑点出现,并于紫外线荧光分析灯下检示.(23)香兰醛-硫酸: 检查高级醇类,酚类,甾体,萜类,芳香油 .喷洒剂: 1 克香兰素溶于 100 毫升浓硫酸,或 0.5 克香兰醛溶于 100 毫升硫酸-乙醇(4:
9、1)中.喷洒后处理: 室温 或 120加热观察显色斑点.(24) 4-二甲氨基苯甲醛,醋酸 ,磷酸(E.P. 试剂): 检查? Azulene 及?前体 Proazulene.喷洒剂: 0.25 克 4-二甲氨基苯甲醛,溶于 50 毫升醋酸 5 克 85磷酸和 20 毫升水的混合液中(棕色瓶中保存数月)?:烃室温即成蓝紫色斑点, 前体于 80加热 10 分钟出现蓝紫色斑点 .(25) 氯胺 T三氯醋酸: 检查强心甙.喷洒剂: I. 3%氯仿 T 水溶液新鲜制备.II. 25%三氯醋酸乙醇溶液(能保存数天).10 毫升 I 加 40 毫升 II,用前混合.喷洒后处理: 110加热 7 分钟,紫外
10、线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光.(26) 亚硝酸基铁氰化钠-氢氧化钠(Legal 试剂): 检查不饱和内酯; 甲基酮或活性次甲基,常用于强心甙喷洒剂: 1 克亚硝基铁氰化钠溶于 100 毫升 2N 氢氧化钠-乙醇(1:1) 的水溶液.显红色或紫色斑点.(27) 3,5-二硝基苯甲酸 (Legal 试剂): 检查强心甙,-不饱和内酯.喷洒剂: 1 克 3,5-二硝基苯甲酸溶于 50 毫升甲醇,加入 1N 氢氧化钾 50 毫升.强心甙呈紫红色斑点.6 糖类(28) 邻苯二甲基苯胺: 检查还原糖 .喷洒剂: 0.93 克苯氨,1.66 克邻苯二甲酸溶于 100 毫升水饱和的正丁醇中.喷洒后处理:
11、 105加热 10 分钟.(29) 2,3,5-Triphenyl-tetrazo lium chloride (T.T.C.)：检查还原糖及其他还原物质。溶液 I：4（ T.T.C.）甲醇溶液； 溶液 II：1N 氢氧化钠。喷洒液：I，II，临用前等体积混合。喷洒后处理：100加热 510 分钟，得红色斑点。(30) Keller-Kiliani 试剂：检查 去氧糖，常用于强心甙。试液：100 毫升冰醋酸加三氯化铁试液 0.5 毫升混合均匀.试样 1 毫克加试液 2 毫克溶解后 ,沿试官管壁滴入浓硫酸 2 毫升,接触面即显棕色,渐变浅绿,蓝色.最后冰醋酸层全部呈蓝色.(31) 1,3-二羟基
12、萘 -磷酸: 检查糖类.喷洒液: 0.2%1,3-二羟基萘 (Naphthoresorcinol)乙醇溶液 100 毫升,与 10 毫升85%磷酸混合.(32) 费林溶液(Fehling): 检查还原糖.溶液 I: 69.3 克结晶硫酸铜溶于 1000 毫升水中.上述二溶液如不清可滤过.临用前等体积混合.7 氨基酸(33) 茚三酮: 检查氨基酸及氨基糖 .喷洒剂: 0.3 克茚三酮溶于 100 毫升正丁醇,加入 3 毫升醋酸;或 0.2 克茚三酮溶于 100 毫升乙醇 (或丙酮中).喷洒后处理: 110加热至斑点出现.(34) 吲哚醌: 检查氨基酸和一些肽 .喷洒剂: 0.2%吲哚醌(Isat
13、in)丙酮溶液,含 4%醋酸;或用 100 毫升 1%吲哚醌丙酮溶液加 10 毫升醋酸.喷洒后处理: 100110加热 10 分钟.(35) 1,2-萘醌 -4-硫磺酸(Folin 试剂): 检查氨基酸.喷洒剂: 新鲜制备 0.02 克 1,2-萘醌-4-磺酸钠,溶于 100 毫升 5%碳酸钠中.喷洒后处理: 室温放于,不同氨基酸出现不同颜色.8 有机酸(36) 酸碱指示剂: 检查有机酸 .喷洒剂: 0.05%溴酚蓝(或溴甲酚绿,或溴麝香草酚蓝)的乙醇溶液.(37) 氧化还原显色剂: 检查有机酸 .喷洒剂: I. 0.075%溴甲酚绿及 0.025%溴酚蓝的无水乙醇液.II. 0.5%高锰酸钾
14、及 1%碳酸钠.10H2O 的蒸馏水液.临用前, 取 I 和 II 按 1:1 混合后喷酒.喷酒后处理: 稳定时间为 510 分钟.对不同的有机酸在纸谱上呈现不同颜色 .(38) ? (Acridine): 检查酸.喷洒剂: 0.005%的?乙醇溶剂.紫外线分析灯下呈黄色荧光.(39) 芳香胺-还原糖: 检查酸.喷洒剂: 芳香胺(如苯氨 5 克)和还原糖(如木质糖 5 克) 溶于 50%含水乙醇中.喷洒后处理: 125130加热出现棕色斑点.氧化苦参碱的提取和鉴定中药苦参是豆科植物苦参(Sophors Flavescens Ait)的干燥根, 味苦,性寒, 有清热燥湿,杀虫等作用.临床上用于治
15、疗痢病,黄胆和皮肤瘙痒症. 近年还发现具有抗肿瘤,升白,抗病毒性肝炎等药理作用,苦参中主要含生物碱, 此外还有黄铜类成分.一, 苦参中主要已知生物碱的结构和性质1.氧化苦参碱（oxymarrine）C12H24N2O2，白 色棱晶，易溶于水，甲醇，乙醇，氯仿，不溶于乙醚，苯。溶点：207208（不含结晶水）162163（含一个结晶水）7778（含多个结晶 水）结晶水可在 1451500。002mmHg 下除去，可于许多金属离子如 Fe2 Cu2+ Cr3+等生成沉淀，？47.7( 乙醇 ).2.苦参碱(matrine)C15H24N2O 在轻石油醚中结晶时，由于温度等条件不 同，可以得到 三种
16、结晶（溶点分别为 76 87 84）和一种流体即 型。通常室温下结晶得到的是 型，易溶于水，甲醇，乙醇，氯仿，溶于苯，在乙醚中溶解度小。？39.11 乙醇3.脱氢苦参碱( 槐果碱)（sophocarpine ）C15H24N2O 白色棱晶。溶点8081，易溶于甲醇乙醇氯仿，略溶于苯和乙醚，在水中溶解度小。 ？-29.44(乙醇)4.槐定(sophoridine)C15H24N2O 白色棱晶，溶点 106108，为苦参碱的一种空间异构体。二实验目的与要求（1） 通过苦参生物碱的提取掌握用渗滤法和离子交换法提取生物碱的方法。（2） 掌握沙氏提取器的使用方法。（3） 掌握氧化铝吸附薄层层离法和柱层层
17、离法鉴定和分离生物碱的方法。三原理氧化苦参碱为喹诺里西汀类生物碱，叔胺氮氧化合物与酸成盐溶于水与非生物碱分开，提取的生物碱盐的阳离子部分与 H+型树脂发生交换生物碱吸附在柱上，吸附有生物碱的树脂，碱化呈游离生物碱，可被氯仿等有机溶剂提取。R-SO3-Na+ H+CL- R-SO3-H+ + NaCLSO3Na + H2O生物碱 四. 实验方法.1 酸水提取和离子交换（1） 渗漉法 取苦参碱 400 克,加入适量 0.5%(g/v)的盐酸湿润后放置一小时，装入渗滤液的PH 值及生物碱反应，使渗滤液通过离子交换脂柱，待经过树脂柱的滤液生物碱反应或微弱的反应时，停止交换，将树脂倒入烧杯中，酮蒸馏水洗
18、涤几次，滤干，树脂放入搪瓷盘中自然晾干。（2） 浸提法 300 克？0.5HCL(g/v) 6 倍量浸泡 48 小时，浸出浸液，。在处理 12 次，2 次浸液全体合并。2 总生物碱的洗脱将晾干的树脂放入烧杯中，加 14氨水，搅匀，使温度适宜（树脂充分膨胀，但又无过剩的水）约用氨水 3060 毫升，静置 20 分钟后，装入沙氏提取器中，用 400 毫升 95的乙醇回流洗脱 45 小时（或用氯仿回流提取 58 小时）回收溶剂至干，所得浸膏用 7080 毫升氯仿溶解，并转入分液漏斗，充分静置 后，弃掉上层油状物，过滤氯酚溶液后用无水硫酸钠干燥，回收氯仿至干，残留物用 2 3 倍量丙酮处理，即析出固体
19、粉末，放置，过滤，得生物碱粗品，丙酮重结 晶一次得浅黄色产品。3 苦参生物碱的氧化铝薄层鉴定。样品：氧化苦参碱标准品，粗品，母液溶剂系统：氯仿：甲醇19 ：1（二次展开）石油醚：乙醚：甲醇9：9 ：1显色剂：改良碘化铋钾（改良 Dragendorff）4 氧化苦参碱的分离与纯制（1） 取 0.2 克氧化苦参碱粗品用少量氧化铝搅伴 ,30 克氧化铝(80120 目,IIII) 装柱(145),先加 30 毫升氯仿洗脱,再用氯仿和甲醇 (99:1)混合溶剂洗脱.速度控制在 1 毫升/分左右,每 10 毫升收集一份,经薄层检识,将氧化苦参碱的流份合并,回收溶剂至干,用少量丙酮溶解,放置吸 晶,得氧化
20、苦参碱纯品, 薄层检识后,干燥,侧溶点.（2） 苦参总碱 0.1 克进行低压柱层析吸附剂:薄层用硅胶 15 克( 已用 NH4OH 减活)洗脱剂:CHCL3 50 毫升,CHCL3-MeOH(98:2)100 毫升,(95:5)100 毫升,MeOH100 毫升流速 1 毫升/分 10 毫升收集一份.5. 氧化苦参碱的还原取氧化苦参碱粗品 1.0 克,溶于 15 毫升 10%盐酸水溶液中,放入 1.0 克锌粉,室温放置,不时摇动,放置 24 小时后过滤,浓度调到 PH=910,用 500 毫升乙醚分多次提取.合并乙醚溶液,无水硫酸钠干燥过夜,回收乙醚淡黄色粘稠体放置于冰箱中,得浅黄色固体,石油
21、醚重结晶后得白色结晶,测熔点.薄层检识氧化铝干板(120 目以上)样品:苦参碱标准品,氧化苦参碱标准品,苦参碱溶剂系统:氯仿:甲醇=8:2显色剂:改良碘化铋钾溶液附:阳离子交换树脂的处理(1) 预处理及转型:将 100 克聚苯乙烯磺酸钠型树脂(交联度 17%粒度范围 1650 目)放入烧杯中,用 80蒸馏水温热使之充分膨胀 1 小时,后加入 2N 盐酸 300 毫升 洗,水洗至 PH57,5%NaOH 浸泡 1H?浸泡过夜(注意开始要搅动几次).次日把树脂装入层离柱,并使全部酸液流过树脂柱,用蒸馏水洗 至中性至无氯离子反应为止,可用于无生物碱交换.(2) 再生将已洗去生物碱的树脂,置渗滤筒中,
22、加 2 倍的 2N 盐酸浸泡过夜, 次日树脂上面的盐酸慢慢流过树脂,用水洗至中性,然后用 5%的氢氧化钠浸泡 12 小时, 时常搅伴,倾倒出上层碱液,用馏水洗至中性,在空气中晾干, 留作下一次使用. 四. 思考题1. 酸水法及离子交换树脂法提取分离生物碱的原理.2. 应如何检查 (1)渗滤液中是否含有生物碱 ?(2)渗滤液中生物碱是否可以被交换在树脂上?(3)离子交换树脂是否已达到饱和? 3. 氧化铝薄层层析的原理是什么? 适用于什么成分的分离鉴定?4. 当用硅胶薄层板层析时应如何操作?五. 参考文献.1. 江苏中医学院 :中药大辞典 上海人民出版社 1977 年2. 张宁芳: 中草药通讯 1
23、977(1):38 1977(2):39. 19773. 中国医科院第五研究室: 放射医学 1977(1):1.19774. 白世泽等 : 中草药 13(4);8.19825. Shigenobu Okuda : Chem Pharm Bull 13:485.1965芦丁的提取,分离及鉴定芦丁(Rutin)亦称芸香苷（Rstinoside ），广泛存在于植物界中，其中以槐米和荞麦叶的含量较高，可作为提取芦丁的原料。槐花米系豆科植物，Sophora japonica 的花蕾，自古作为止血药。槐花米中所含主要成分芸香苷有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要为防止高血压病的辅助治疗药物。此外，芦丁对
24、于放射性伤害所引起的出血症亦有一定作用。一实验的目的和要求1 以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。2 掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷，甙元和糖部分的鉴定方法。3 通过？皮素紫外吸收光谱的测定及应用化学位移确定黄酮类烃基位量的方法。4 通过？皮素与其五乙酰化合物的红外光谱测定该化合物的功能团并与标准谱对照。二槐花米中已知主要成分的理化性质：槐花米中芦丁的含量可高达 20，另含少量的皂苷，皂苷水解后，可得到桦皮醇（Betulin C30H50O2）及槐二醇（Sophoradiol，C30H50O2）。1 芦丁（芸香苷 Rutin）本 品为淡黄色细小针状结晶，C27H36O16。3H2O，M
25、P 为 177178，无水物 MP190（不完全），214215发泡分解。芦丁溶于热 水（1：200），难溶于冷水（1 ：8000）；溶于热乙醇（1：7），冷乙醇（ 1：100）；热乙醇（1：30）。冷乙醇（1：300），难溶于乙酸乙 酯，丙酮，不溶于苯，氯仿，乙醚，及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。2？皮素（ Quercettin）即云香苷苷元，为黄色结晶，C13H10O7，MP313314，无水溶点 316。？皮素溶于热乙醇（1 ：23），冷乙醇（1：300）。可溶于冰醋酸，吡啶，乙酸乙酯，丙酮等溶剂。不溶于石油醚，苯，乙醚，氯仿和水中。3 皂苷易溶于水，吡啶，能溶于甲醇。
26、经酸水解后得桦皮醇及槐二醇，均溶于苯，乙醚，氯仿，丙酮，乙酸乙酯，乙醇，甲醇。三自槐花米中提取芦丁：1 提取方法：方 法 1 ：取槐花米 40 克（完整），置于 100 毫升烧杯中，用冷水快速清洗去泥沙等杂质沥干水，加 0.4硼砂水沸熔液 400 毫升, 直火加热微沸,即时侧 PH值, 当 PH 数值改变成微酸性时,以石灰乳调至 PH8,继续加热微沸 30 分钟, 随时补充水份,同时保持 PH8,静置约 510 分钟,倾出上清液,用尼龙布过滤, 重复提取一次,合并滤液,将滤液用盐酸调至 PH3 左右,再加泥泊金, 放置过夜,抽滤用水洗 34 次,空气自然干燥得粗芦丁.方法 2：取槐花米 20
27、克,置于 500 毫升圆底烧瓶中, 加乙醇 150 毫升,加热回流1 小时,稍冷后抽滤 ,滤渣再加乙醇 100 毫升回流 1 小时,合并乙醇提取液, 放冷,析出絮状沉 淀.过滤,滤液浓缩至 50 毫升,放置过夜,析出结晶 ,滤去母液继续浓缩一半,放置又析出结晶.合并结晶,用乙醚 3050 毫升分次洗去脂溶性成分 (油脂, 叶绿素等),再用丙酮 10 毫升洗涤一次 ,得粗芦丁.2 重结晶方法方法一：取粗芦丁 2 克，加乙醇 5060 毫升加热溶解，呈热抽滤，将滤液浓缩至 2030 毫升，放置，析出结晶，母液再浓缩一半，又析出结晶。合并结晶再用乙醇重结晶一次。方法二：取粗芦丁 2 克，加去离子水或
28、蒸馏水 400 毫升，加热煮沸，趁热煮沸，趁热抽滤（以滑石粉助滤）；放置过夜析晶（或放冷析晶）。抽滤。得精制芦丁。思考题：提取芦丁工艺中影响产量和质量的因素是什么？为什么药加硼砂水溶液？记录：粗芦丁得率多少？精制芦丁得率多少？溶点？3 芦丁的水解取 芦丁 1 克，加 2H2SO4 80 毫升，小火加热微沸回流 30 分钟至 1 小时。开始加热 10 分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即？皮素，抽滤取结晶（保留滤液 20 毫升，以检查其 中所含单糖），加 50乙醇（按 1 克 90毫升量）加热回流使？皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置结晶，抽滤得精制品，在减压下 110干燥可得？皮素无水物。 测
29、熔点，进行纸层析法鉴定。思考题：芦丁水解不完全时将产生什么结果？记录：芦丁的水解产物是什么？主要产物得率？溶点？四芦丁，？皮素，糖及？皮素衍生物的鉴定：1 纸层析：新华一号层析滤纸样品：自制芦丁，？皮素对照品：芦丁，？皮素展开剂：（1 ）正丁醇醋酸水（ 4：1：5 上层或 4：1：1 ）（2）25醋酸水溶液（3）85醋酸水溶液显色： （1）可见光下观察，再在紫外灯下观察（ 2）经氨气熏后再观察（ 3）喷三氯化铝试剂后再观察2 芦丁和？皮素的聚酰胺薄层鉴定：样品：同纸层析展开剂：乙醇水（7 ：3）显色：同纸层析3 糖的检出 纸层析法取上述滤出？皮素时保留的水解滤液 200 毫升，加 Ba(OH)
30、2 细粉（约 2.克）中和至 PH7,滤除生成的 BaSO4 沉淀(可用滑石粉助滤),滤液浓缩至 1 毫升, 供纸层析法点样用.展开剂：正丁醇醋酸水（4：1 ：5 上层或 4： 1：1）对照品：葡萄糖，鼠李糖水溶液显色剂：苯氨邻苯二甲酸试剂喷后，105烘 10 分钟，显棕色或棕红色斑点。4 红外光谱测定：5 ？皮素五甲醚的制备：取？ 皮素结晶 400Mg 置于 150 毫升三颈瓶中，加 50 毫升无水丙酮，装上电动搅拌器，冷凝管及温度计，加热回流搅拌，每间隔一适当时间加入无水碳酸钾 0.2 克和硫酸二甲醇 0.2 毫升,大约 1.5 小时后加完 4 克无水碳酸二甲酮,继续加热回流搅拌直至溶液黄
31、色完全消退为止,约需 45 小时,停止加热, 取下烧杯, 反应液经过滤,沉淀用热丙酮洗涤数次,合并系,滤液, 蒸馏回收部分丙酮,留存1015 毫升,放置,渐渐析出无色结晶,表示过?的硫酸二甲酯存在,应加 5%NaOH数滴,振摇使硫酸二甲酯水解,此时又可析出一小部分结晶(检查所析出结晶对1%FeCL3 的反应,甲基化完全者呈负反应), 合并,以乙醇重结 晶, 得?皮素五甲醚(MP152153).甲基化不完全者时对三氯化铁出呈正反应,主要产品为 3,7,3”,4”甲醚,MP161161.5.6？皮素的降解取？皮素 50Mg，置于 50 毫升的圆底烧瓶中，加水 50 毫升，乙醇 6 毫升，KOH？，
32、置水浴上加热回流 10 小时，蒸去乙醇，加水 50 毫升溶解，用稀盐酸酸化至 PH23 ，用乙醚萃取 3 次，合并乙醚液，回收乙醚，蒸滞小体积供薄层层析点样用。7？皮素降解产物的薄层层析：硅胶CMCNa 薄层对照品：原儿茶酸（Protocatechuic acid），间苯三酚 9Phlorogluoinol)。展开剂：氯仿丙酮醋酸（8：2 ：0.5）显色剂：三氯化铁试剂思考题：（1） 芦丁和？皮素用不同展开剂系统展开层将出现什么结果？为什么？（2） 芦丁和？皮素聚酰胺薄层将出现什么结果？为什么？（3） 试比较？皮素红外光谱图和五酰基？皮素红外光谱图的差异。记录：（1） 芦丁和？皮素的纸层析，聚
33、酰胺薄层层析结果。（2） 糖的检出纸层析结果。8紫外吸收光谱测定？皮素（一） 原理利用紫外吸收光谱，测定黄酮化合物在加入各种电解质或络合剂后吸收峰的位移，根据位移的情况，以判断该化合物烃基的额位置。（二） 试剂配制1 无水乙醇：用分析纯的甲醇，加入 10CaO，放置 24 小时后并加热回流1 小时，回流时冷凝管顶端应安装 CaCL2 干燥管，然后蒸馏得无水甲醇。2 甲醇钠溶液：取 0.25 克金属钠,剪碎,小心的加入无水甲醇 50 毫升中, 放置24 小时后全溶.3 氢氧化钠溶液：取 2.5 克无水三氯化铝,加 10 毫升水溶解.4 三氯化铝溶液： 2.5 克无水三氯化铝(呈黄绿色)小心的加入
34、无水甲醇 50 毫升中,放置 24 小时后全溶.5 醋酸钠：用水粉状醋酸钠。6 硼酸饱和液：将无水硼酸加入适量无水甲醇，制成饱和溶液。依照上述方法制备的贮备液可放置 6 个月。(三)测定方法： 酮烃基位置的测定：精密称取黄酮样品（？皮素）约.mg，用无水甲醇溶解，在稀释至 100毫升。（1） 黄酮光谱：取样品溶液约 3 毫升置于石英杯（ 1CM）中，在200300nm 波段内进行扫描。重测一次，视光谱的再现性。（2） 氢氧化钠光谱：取样品溶液约 3 毫升置于石英杯中，加入氢氧化钠溶液23 滴立即测定。放置 5 分钟后，在进行测定。（3） 甲醇钠光谱：取样品溶液约 3 毫升置于石英杯中，加入甲醇
35、钠溶液57 滴后，立即测定。放置 5 分钟后，再进行测定。（4） 三氯化铝光谱：在盛有约 3 毫升样品溶液的石英杯中，加入三氯化铝溶液 6 滴，放置 1 分钟后进行测定。测定后，加入 3 滴盐酸溶液（浓盐酸：水1：1），再进行测定。（5） 醋酸钠光谱：取样品溶液约 3 毫升置于石英杯中，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀；杯底剩有 2mm 的醋酸钠后，二分内进行测定。（三） 测定结果：？皮素加位移试剂结界表（）加入试剂 编号 II 峰 I 峰 位移值 羟基无水甲醇 1 256 371 NaOH 2 430 I 峰59 4 OHNaOH 5 2 分解 分解 3，4OHMeONa 3 416 I 峰4
36、5 3OHMeONa5 3 分解 分解 3，4OHALCL 4 270 450 I 峰79 3，5 及 3，4OHALCL， HCL 4 265 425 I 峰54 3，4 OHNaAc 5 277 387 II 峰21 7OHNaOAcH3BO3 6 259 385 I 峰14 3，4OH克分子吸收系数的测定：根据已测定的黄酮光谱，测量吸收峰的波长和吸收峰前后 20nm 的波长范围。然后取样品溶液约 3 毫升，置于 1cm 的石英杯中，用紫外光谱仪，仔细测量在上述波长范围内的各波长的吸收值，反复测定 3 次。记录：（1） 位移测定结果（2） 测定克分子吸收系数皂吸收峰前后 20nm 波长范围
37、内，依次测定波长和吸收值，用方格纸作图，精确的测出吸收峰的波长和吸收值，记录测定结果。薄层层析应用一.定性点滴反应1.样品(1).氨基酸混合液(2).薄荷油(3).芦丁甲醇溶液(4)甘草次酸乙醇液(5)原儿茶酸乙醇液(6)小檗碱乙醇液 2.检出试剂(1).三氯化铁 1%乙醇溶液(2).三氯化铝 1%乙醇溶液(3).茚三酮 0.2%乙醇溶液(4).碘化铋钾(见附录 I)(5).*香草醛- 硫酸 0.5%硫酸-乙醇(4:1)溶液(6)?酸 5%乙醇溶液.3.实验方法.取硅胶 CMC-Na 薄层板 12 块,用软铅笔按下图划线,构成方格, 将各样品先滴加于相应的格子中,再将各试剂分别自空白其 5 逐
38、点点加试剂,观察并记录反应变化.具腐蚀性试剂也可用空白磁板.(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 空白 (1) (2) (3) (4) *香草醛-硫酸为 1 克香草醛(Vanillin)溶于 100 毫升浓硫酸,或 0.5 克香草醛溶于 100 毫升硫酸 -乙醇(4:1)中,喷洒后用电吹风加热至 120,观察颜色变化.二.鉴别中草药中的化学成分1. 单向展层例一. （1） 硅胶 CMC-Na 薄层 (载玻片板)(2) 样品 薄荷油, 薄荷脑的 0.1%乙醇溶液（3）展开剂 石油醚乙酸乙酯石油醚乙酸乙酯（85 ：15 ）（4）显色剂 香草醛硫酸（压板法）点样展层后，稍干，后扣在
39、一块同样大小并涂布一层（不可多加，多了会使斑点扩散）显色剂的玻璃板上，压紧稍后一下，取除玻璃片，使薄层面向上，观察层面向上，观察颜色变化。由结果判断何种展开剂最适合分离薄荷油？例二 （1 ）硅胶 CMCNa 薄层（载玻片板）（2）样品四季青提取物原儿茶碱（Protocatechuic Acid）1 乙醇溶液原儿茶碱（Protocatechuic Acid）1 乙醇溶液（3）展开剂 石油醚氯仿甲醇氯仿：丙酮（8 ：2 ）氯仿：丙酮：甲醇：醋酸（7：2 ：0.5：0.5）(4) 显色剂 三氯化铁 1%乙醇溶液由展层结果判断选用何种展开剂为最合适?展开剂中为何药加醋酸。2 双向展层 （1） 硅胶 C
40、MC-Na 薄层板（88cm ），不活化。在薄层板距两边各 1.5cm交点的地方点样品。（2） 样品？氨基酸（精氨酸，脯氨酸，亮氨酸的 1水溶液）（3） 展开剂：第 I 向为正丁醇醋酸水（4 ：1 ：1）（V/V）第 II 向为苯酚水（75： 25）（W/W）（苯酚需要蒸后使用）第一向展开剂展层后，用热风吹使溶剂挥发，再将样品已展层的一向作起始线，在第 II 向溶剂中展开。（4） 显色剂： 0.2茚三酮乙醇溶剂，喷洒后，以电吹风见加热（ 110）显色，观察各斑点的颜色变化。最后喷洒 2硫酸水溶液固色。3硝酸银硅胶薄层（1） 硝酸银硅胶悬浮浆的制备（2.5 AgNO3 制硅胶薄层）：用 20 克
41、硅胶G 和 55 毫升水中含 5g 硝酸银（8）的溶液调制成，阿波常法捕薄层板（47cm，约 30 块）。避光阴干后于 105活化半小时避光储存备用。（2） 样品： 1，龙脑 2，香橙醇 3，牛龙牛儿醇（3） 展开剂： 10的硫酸乙醇液 二氮甲烷：氯仿：乙酸乙酯：正丁醇45：45：4.5：4.5（4） 显色点： 110加热三 薄层板上原位化学反应本法使直接在薄层板上进行的化学反应，又称原位反应薄层。先将样品滴加在薄层板上，然后滴上适当的溶剂展开反应物。有时先在试官内进行反应，而后在薄层板 上进行层析检识。根据原化合物的 Rf 值再联系产物的层析行为，Rf 值，可供鉴别一个化合物或者提供鉴定一个
42、化合物有价值的线索。应用这些特殊反应只消耗未 知物极微量的样品却提供了有关结构鉴别的信息，操作简便。如氧化，还原，脱水，水解，卤代，酶的催化作用，酯化，硝化，衍生物的制备，混合反应等均可在薄 层板上进行。例： 酯化反应（1） 取原儿茶酸乙醇溶液，在一薄层板上点两个相同的样点，其中一份样点的原点上，再点加试剂：醋酸吡啶（3：1 ），待溶剂挥发后，再重复点加试剂几次，干 后，以氯仿丙酮（8：2 ）展开。（用点蒸气熏显色，可见其中点加醋酐吡啶试剂的样点已展来在前，而未加试剂的样点仍在起始线）。两者Rf 值不同的理由 是：？（2） 取原儿茶醛乙醇，在同一薄层上点加两个相同的样点，其中一分样点的原点上，
43、在点加酸酐吡啶（3：1 ），待试剂挥散后，在重复点加试剂数次，用氯仿丙酮（8 ：2 ）展层。用 2，4 二硝基苯肼显色，可显示加酰化剂前后样品点有什么变化。 成盐反应取 原儿茶醛乙醇溶液，在同一薄层板的起始线上点加 2 个相同样点，其中一份样点的原点上，再点加 10碳酸氢钠溶液（另一份不加），以氯仿丙酮甲醇 （8：2：1）展层，并用三氯化铁乙醇溶液喷雾显色，可见其中点加碳酸氢钠的样点 Rf 值已有变化，未加碱的样点照常展开。为什么？ 苯氨反应取 原儿茶碱乙醇溶液，在同一薄层上点两个相同的样点，其中一份样点的原点上，在点加 2，4 二硝基苯肼试剂，给以热风以促使呈腙反应，然后以氯仿丙酮 （8：2
44、）展层，可见出现两个棕红色斑点。在红棕色斑点下，再喷以三氯化铁试剂，又出现紫蓝色斑点。上面的红棕色斑点是原儿茶碱与 2，4 二硝基苯肼所形 成的胺，下面紫蓝色斑点是剩下的部分未成腙的原儿茶醛。2，4二硝基苯肼的斑点呈黄色， Rf 值最大。由原位反应的结果判断原来化合物的结构上有何集团特征。并绘制出薄层层析图谱。4 化合物纯度的检测：（1） 化合物纯度的检查，可采用的方法测溶点，对纯品而言，溶点距 12之间（2） HPLC 法显示一个主降 按面积归一法，应.95（3） 薄层层析法，按药典规定制备薄层点样 100g 展距 17cm 未见杂质斑点，操作同上，只是需配制一定浓度的检测液定量点样。纸层析
45、的应用鉴别天然产物中的糖类,氨基酸等极性化学成分常被采用 .多缓冲溶液和碱性纸层析法的应用(原理属分配分离)一. 混合单糖的 PC(1). 层析滤纸按纤维长丝方向(纵向)切成适当大小的纸条, 在一端 2cm 处用铅笔划一条线为起始线，在起始线上点样，点样斑点的直径小于 0.3cm，点间距11.5cm。（2）样品： 2.5葡萄糖 鼠李糖混合溶液（3）展开剂：正丁醇醋酸水（4 ：1：1 或 4：1 ：5 上层）（4） 显色剂：邻苯二甲酸苯氨试剂*喷雾后于 105加热 10 分钟。呈现桃色或棕色。记录：贴 PC 滤纸条葡萄糖 Rf：鼠李糖 Rf：二混合氨基酸的 PC阿胶水解液（1） 层析滤纸 5*2
46、0cm 一张，点样同上。（2） 样品：阿胶酸水解液，猪阿胶酸水解液（3） 展开剂：正丁醇：甲醇：水（15：3：2）（4） 显色剂： 0.2茚三酮乙醇液记录：贴 PC 滤纸条比较二种阿胶所含氨基酸是否一样三多缓冲液和碱性纸层析法（一） 蒽醌衍生物的分离 苯氨邻苯二甲酸试液为苯氨 0.93 克和邻苯二甲酸 1.66 克溶于 100毫升正丁醇（用水饱和）中。（1） 缓冲滤纸的制备：取新华滤纸（3*12cm）一张，距下端 2cm 处划一起始线，向上面每隔 1.5cm 划一平行线按右图在各条带上图布 PH 缓冲液和碱液，然后将其夹在两片滤纸中吸至半？使润湿指数为 1.5 倍）备用。（2） 样品：大黄素（
47、 Emodin） 大黄素甲醚（Physcion） 芦荟大黄素（Aloe-emodin）大黄酸（Rhein）的氯仿溶液。（3） 点样：每隔 2cm 点样。（4） 展开剂：氯仿（5） 显色剂：荧光检出（6） 结果：记录图谱，并说明这些化合物的酸度。附 PH 缓冲液的配置：PH3：取 0.2M 磷酸氢二钠溶液 4.1ml 加 0.1M 柠檬酸 15.89 毫升配成。PH5：取 0.2M 磷酸氢二钠溶液 10.30ml 加 0.1M 柠檬酸 9.70 毫升配成。PH8：取 0.2M 磷酸氢二钠溶液 19.45ml 加 0.1M 柠檬酸 0.55 毫升配成。PH9.9：取 0.1M NaCO3 5ml
48、加 0.1M NaHCO3 5 毫升配成。0.2M Na2HPO4 溶液含 35.61 克升0.1M 柠檬酸溶液含 21.01 克升0.1M NaCO3 溶液含 28.62 克升0.1M NaHCO3 溶液含 8.40 克升（二） 叔胺碱的分离：（1） 缓冲滤纸的制备：操作同上，配置五种不同的 PH 值的缓冲液，PH 值分别为 6.0，5.4，5.0，4.6，4.0。（2） 样品：粉防己甲素（Tetrandrine） 粉防己乙素（Fangchinoline），轮环藤酚碱（Cyclonoline ），粉防己总生物碱乙醇液。（3） 展开剂：氯仿（4） 显色剂：改良碘化铋钾（5） 结果：记录图谱，并说明这些生物碱的碱度强弱。附 PH 缓冲液的配制：PH4.0：取 0.2M Na2HPO4 溶液 7.71 毫升加 0.1M 柠檬酸溶液 12.29 毫升配成。PH4.6：取 0.2M Na2HPO4 溶液 9.35 毫升加 0.1M 柠檬酸溶液 10.65 毫升配成。PH5.0：取 0.2M Na2HPO4 溶液 10.30 毫升加 0.1M 柠檬酸溶液 9.70 毫升配成。PH5.4：取 0.2M Na2HPO4 溶液 11.15 毫升加 0.1M 柠檬酸溶液 8.85 毫升配成。PH6.0：取 0.2M Na2HPO4 溶液
