1、 中枢药物筛选与兴奋药 LD50 测定的设计性实验 学院： 药科学院【摘要】目的：了解中枢兴奋药的药效及临床表现，从三种未知的药物鉴别与筛选出目标药物中枢兴奋药，进行试验设计，通过前预实验，观察中枢兴奋药对小鼠的毒性反应，确定中枢兴奋药的LD50。方法：通过查书籍文献确定小鼠对中枢兴奋药和抑制药的一般反应，通过腹腔注射三种未知药物筛选出目标药物。在预实验中测出中枢兴奋药的 LD0 为 187.5mg/kg，和 LD100 为 375mg/kg，按照1:0.84 的组距设 5 组，通过 LD50数据处理软件用 Bliss 法测定中枢兴奋药的 LD50，同时观察记录各组小鼠的毒性反应。结果：目标药
2、物的 LD50为 227.3mg/kg,95%可信限为 145.1356.1mg/kg，该药对小鼠产生的一般毒性反应为挠脸，竖尾，增加剂量是跳跃，口吐白沫，抽搐的毒性反应发生率有所增加。结论：7 号药为生理盐水，8 号药为中枢兴奋药，9 号药为中枢抑制药。该中枢兴奋药的 LD50为227.3mg/kg。 前言目前作用于中枢神经系统的药物种类很多， 如抗焦虑药、抗抑郁药、催眠药、抗震颤麻痹药和抗精神失常药等。 作用于中枢神经系统的药物主要影响递质和受体，中枢神经系统不但神经递质种类较多，而且神经激素及神经调质也起到重要作用。这类药物用药时间长，副作用出现频率高，有可能出现不可逆的后遗症；有的药物
3、过量服用，还可能引起死亡，对此必须高度重视。另外，对制药行业来说，年销售规模达到 650 亿美元的作用于中枢神经系统（CNS）药物或许是最具挑战性，同时又是回报最丰厚的市场之一。专业人士分析，抑郁是最常见的精神疾病，据统计，全球约有 1.2 亿人罹患此病，世界卫生组织（WHO）预测，到 2020 年，抑郁症将成为人们失去生活能力的一个主要原因。在 CNS 药物市场中最大一部分 是抑郁症药物市场。快速增的 CNS 药物市场中，仍有许多尚未得到满足的临 床需求以及新的治疗方法，对那些已经积极介入或正在考虑介入该市场的制药公司来说，CNS 药 物市场无疑是一块极具吸引力的”蛋糕” .由于中枢兴奋药有
4、巨大的经济效益，对中枢神经系统的药物的研究很有必要。其中，中枢兴奋药是能提高中枢神经系统机能活动的一类药物，药物的药理毒理评价是药物临床前期的必要内容，其常用的方法便是测定其半数死量（Lethal dose 50%,LD50）,它是衡量药物毒性大小的指标，评价药物安全性和药物优劣的重要参数。本实验就是对未知中枢兴奋药的 LD50进行测定及观察其引起的毒性反应。【关键词】 兴奋药 LD50 毒性 Bliss 法1. 实验目的学习如何筛选有效的药物，通过设计性实验锻炼和提高科学研究的思维方式、药理学实验设计原则和方案。最终达到提高学生发现问题、提出问题、分析问题和解决问题能力，提高学生的自学能力、
5、实践能力和团队协作能力，培养学生的科学思维和创新能力。2.实验器材 2.1. 器材鼠笼，电子天平，注射器，针头，小烧杯2.2. 药品中枢性药物，生理盐水，蒸馏水2.3. 动物体重 1822g 健康小鼠 68 只，雌雄各半（雌鼠应无孕），（预实验 18 只，正式实验 50 只）3.实验方法3.1. 预实验3.1.1. 中枢药物的鉴别与筛选3.1.1.1.随机捉取 3 只小鼠，腹腔注射未知三种药物，分别根据小鼠的反应对待测的 3 种药物作出鉴别和筛选，并从中找出目标药物中枢兴奋药进行后续的实验。3.1.2. 药物 LD0及 LD100测定3.1.2.1. 捉取 15 只小鼠，随机分成 5 组，每组
6、 3 只，然后称重，编号，记录数据。3.1.2.2.以中枢兴奋药的临床表现，分别对原药进行一定浓度的稀释混匀（本组队原药稀释的比例为1/2,1/4,1/5,1/6,1/8）, 后分别对每组小鼠腹腔注射稀释药剂（0.2ml/10g），观察每组小鼠的实验现象并进行数据记录。3.1.2.3. 根据实验结果，推测出受测药的 LD0和 LD100。3.2. 正式实验3.2.1.实验分组抽取 50 只小鼠随机分成 5 组，每组 10 只，尽可能使小鼠的体重相对均匀，后分别对小鼠进行标记称重，记录数据。3.2.2.药物剂量计算及药液配制3.2.2.1.根据预实验的结果找出 DMIN,DMAX，设正式实验剂量
7、组数为 n，剂量公式比 r，则 r=（D min/Dmax)(1/(n-1) 各组剂量为 Dmax*r(k-1),k 为第几组，一般选用 47 组动物，r 为 0.60.85 为宜。我组测得经预实验得最小剂量（Dmin）：187.5mg/kg,最大剂量（D max）：375mg/kg。当 n=5 时，r=0.841.375mg/kg2.375mg/kg*0.84=315mg/kg;3.375mg/kg*0.842=264.62mg/kg;4.375mg/kg*0.843=222.26mg/kg;5.375mg/kg*0.844=186.70mg/kg3.2.2.2.药液配制药源紧张时的配药方法
8、各组所需母液的体积（ml）为：第一组 1.5 第三组 1.26 第五组 1.06 第四组 0.89 第五组 0.75 母液总体积（V）=10*（1+0.84+0.84 2+0.843+0.844+0.845)总药量（M)=母液总体积 x*Dmax /(20ml/kg)各剂量组药液按下法稀释：1.用移液管精密量取 1.5ml，用蒸馏水稀释至 6ml，为一组药液2.用移液管精密量取 1.26ml，用蒸馏水稀释至 6ml，为二组药液3.用移液管精密量取 1.06ml，用蒸馏水稀释至 6ml，为三组药液4.用移液管精密量取 0.89ml，用蒸馏水稀释至 6ml，为四组药液5.用移液管精密量取 0.75
9、ml，用蒸馏水稀释至 6ml，为五组药液3.2.3.给药对各组小鼠进行腹腔注射相应浓度的药液（0.2ml/10g），观察并记录给药后 2 小时内小鼠的反应情况（是否死亡），最后进行数据处理，并按照 Bliss 法计算 LD50值及其 95%可信限。4.实验结果与数据处理4.1.预实验表 1. 鉴别药物实验情况表 2 . LD0和 LD100的设计实验情况通过预实验测定，可推测该兴奋药物的 LD0LD100 的范围为 187.5mg/kg375mg/kg。组别 编号 小鼠反应 药物1 7 无特别反应 生理盐水2 8 直立、呼吸急促、乱窜、咬舌、死亡 兴奋药3 9 抽搐、死亡 抑制药小组(每组 3
10、 只) 注射剂量（ mg/kg)小鼠反应 死亡率1 750 乱窜、跳动、咬舌、3 只小鼠均死亡100%2 375 乱窜、跳动、咬舌、3 只小鼠死亡 10%3 300 乱窜、跳动、有一只小鼠死亡 33.3%4 250 乱窜、跳动、有 1 只老鼠死亡 33.3%5 187.5 小鼠给药前后无特殊反应 0%4.2.正式实验【实验结果】结果记录于下表表 3.小鼠对不同剂量兴奋药的反应分组 注射剂量 小鼠反应 死亡率（mg/kg）1 375 乱窜、跳动、咬舌、10 只小鼠均死亡 100%2 315 乱窜、跳动、咬舌、有 9 只小鼠均死亡 90%3 264.6 乱窜、跳动、咬舌、有 6 只小鼠均死亡 60
11、%4 222.3 乱窜、跳动、有 1 只小鼠均死亡 10%5 187.5 乱窜、跳动、有 1 只小鼠均死亡 10%按 Bliss 法计算 LD50 和 95%可信限。Bliss 法计算较为繁琐，先多采用计算机软件进行计算。表格 4.中枢神经兴奋药对小鼠 LD50 测定数据按 Bliss 法计算 LD50 和 95%可信限。Bliss 法计算较为繁琐，先多采用计算机软件进行计算。回归线方程为：Y=-186.5959+81.3009X,(r=0.7636)a=0.01 时，查得的 r 为：0.9590所以 LD50=227.3151750mg/kg置信系数 a=0.05 时的置信区间为：145.0
12、914LD5 0356.1346，0.1950组别 剂量（mg/kg)对数剂量（x）动物只数 死亡动物数死亡率（%）几率单位（Y)1 375mg/kg 2.574 10 10 100% 33.0002 315mg/kg 2.498 10 9 90% 6.2803 264.62mg/kg 2.423 10 6 60% 5.2504 222.26mg/kg 2.347 10 1 10% 3.7205 186.7mg/kg 2.273 10 1 10% 3.7205 讨论5.1.实验注意事项动物分组要做到随机性 实验中能控制的因素尽量使之均衡化，难以控制得因素也应力求严格随机化。分组时应先将不同性别
13、分开，再将不同体重分开，然后随机分配，此法称为分层随机分组法。给药途径的选择 药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主，选取的途径必须包括推荐临床给药途径。LD 50测定方法有很多，较常用的有寇氏法（Karber 法）、加权几率单位发（Bliss 法）、目测几率单位法、综合法、序贯法等。其中 Bliss 法被认为是目前最经典、最精确的方法，受到我国新药临床前毒理学研究指导原则的推荐，计算相当复杂，现可用计算机和相应软件来完成，可化繁为简。5.2.实验结果分析本实验是作用于中枢神经系统药物的设计性实验，我们首先要做的就是了解中枢神经系统药物的特点。作用于中枢神经系统的药物从作用机制上来
14、看， 绝大多数药物的作用方式是通过影响突触化学传递的某一环节（如影响递质的生成、贮存、释放和灭活的过程；激动或阻断受体）而产生药理效应；尚有少数药物是通过一般地影响神经细胞的能量代谢或膜稳定性而产生作用。 作用于中枢 神经系统的药物产生中枢兴奋效应时的表现为欣快、失眠、不安、幻觉、妄想、躁狂、惊厥等；出现中枢抑制效应时则表现为镇静、抑郁、睡眠、昏迷等。预实验时，观察三组试样药物注射完后小鼠的表现，第一只小鼠没出现任何异常现象。第二只小鼠变得很暴躁，上下跳动，异常活泼，呼吸加快，最后死亡。第三只小小鼠变得安静嗜睡，呼吸微弱，10min 后死亡。由此推断三种药物分别是生理盐水，兴奋药，抑制药。 实
15、验过程中，给药浓度较高的小鼠死亡的速度和数量都比用药浓度低的小鼠快和多，说明小鼠是否死亡和用药浓度在一定区间内呈正相关。 我们都知道，药物剂量是影响药物效应的重要因素。不同的剂量可以激活剂量相关靶点,所以同一种药物的多种作用及其不良反应与剂量有着密切的关系。药物剂量与药物发现存在着相互联系。 一种药物在使用过程中,由于剂量的不同,会出现新的药物效应,有利于发现新的药物靶点,加快药物发现的速度。药物发现的研究方法,尤其是涉及药物安全性评价方法,将直接影响药物剂量的确定。 . 5.3.实验体会与心得 .这是我们第一次做自主设计性药物实验方案，在这次药理学的中枢性药物设计实验中，我们通过查找阅读大量
16、的文献，独立思考，小组讨论的方式来设计并完成整个实验的。锻炼了我的综合实验技能，很大程度上提 高了我的动手能力和思考能力。 . 本次实验中有效地培养和提高了我们的团队协作能力，同时也使自身的责任感得到加强。 . .6.结论 、预实验：7 号药为生理盐水，8 号药为中枢兴奋药，9 号药为抑制剂。测出我们组兴奋药能引起的最大剂量 375 mgkg，最小剂量 187.5mgkg。正式实验：小鼠是否死亡和用药浓度在一定区间内呈正相关，未知兴奋药的 LD50=227.3151750mgkg1谭毓治主编，药理学实验指导，科学出版社，2012,7（第 229 一 246）2李宇华；李学军 剂量与药物治疗机药物发现的关系 医药导报 2007 年 01 期 （第 13 页）
