1、SDS-PAGE 凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺 4g，双蒸水 500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光 4保存；2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl 分离胶缓冲液：18.15g Tris，用 1mol/L HCl 定容至 100ml，棕色瓶避光 4保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl 分离胶缓冲液：12g Tris，用 1mol/L 调 pH 至 100ml，棕色瓶避光 4保存；4. 10% SDS 溶液：10g SDS 加水定容至 100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP 溶液：0.
2、1g AP（过硫酸铵）加水定容至 1ml，用前新鲜配制；6. 1SDS-PAGE 电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L） ，192mM 甘氨酸（14.41g/L） ，0.1%SDS（1g/L） ，pH 8.30；7. 染色液 ：0.25g 考马斯亮蓝 R-250 溶解于 45ml 甲醇， 45ml 水，10ml 冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml 甲醇，45ml 水，10ml 冰醋酸；9. 固定液：50ml 甲醇，40ml 水，10ml 冰醋酸；10. 2SDS-PAGE 上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333m
3、l，甘油0.2ml，1% 溴酚兰 10L，-疏基乙醇 100L，加水定容至 1ml，分装后-20保存。二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品 1g，加入 3-5ml 蒸馏水进行搅拌溶解 1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm 离心 10min，取离心上清液等体积加入 20%的三氯乙酸聚沉 30min，离心，弃去离心上清液，用 70%的丙酮溶液洗涤沉淀， 4000rpm 离心 10min，重复洗涤 3-5 次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS 溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液等
4、体积加入 20%的三氯乙酸聚沉 30min，离心，弃去离心上清液，用 70%的丙酮溶液洗涤沉淀， 4000rpm 离心 10min，重复洗涤 3-5 次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS 溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。2. 蛋白含量相对较高的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品 1g，加入 3-5ml 蒸馏水进行搅拌溶解 1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm 离心 10min，取离心上清液用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。3. 未知样品对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶） ，根据已知电泳图谱确定该类
5、物质能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围，在对未知样品进行电泳实验前，测定其蛋白含量，根据其结果进行适当处理。三、凝胶的配制1. 设备检漏将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置 15-20min，观察是否有水浸出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除进行重新安装，并重复检漏至无液体浸出。注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防止跑胶时短路。2. 分离胶的制备根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的 SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围如下表蛋白质分子量范围（ KD） 适宜的凝胶浓度（%）100 830-100 1010-30 1210 1
6、5将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行 SDS-PAGE 分离胶的配制（使用凝胶试剂盒）电泳凝胶浓度试剂 8% 10% 12% 15%H2O（ml） 4.63 4.0 3.3 2.330%Acr-Bis（29:1） （ml ） 2.67 3.3 4.0 5.01.5mol/L Tris.cl（pH 8.8） （ ml） 2.5 2.5 2.5 2.510%SDS（ml） 0.1 0.1 0.1 0.110%AP（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED（l） 4 4 4 4总体积（ml） 10注：如室温高于 30，可适量减少 TEMED30-50%，防止胶过快凝结；如室温低于 20，可适量增
7、加 TEMED30-50%，防止胶过慢凝结。常用分离胶的浓度为 10%。按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，迅速进行注胶，注胶过程要平稳，避免产生气泡，注胶完成后用蒸馏水进行水封（水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化） ，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。3. 浓缩胶的制备分离胶制备完成后，静置 60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸把剩余的水分吸干，按下表进行 SDS-PAGE 浓缩胶的配制。试剂 浓度（5%）H2O（ml） 4 230%Acr-Bis（29:1） （ml） 1 0.51.0mol/L Tris.cl（pH 8
8、.8）（ml） 1 0.510%SDS（l） 80 4010%AP（l） 60 30TEMED（l ） 8 4总体积（ml） 6 3所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5mm 处，迅速插入样梳（样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平） ，静置 40-60min。4. 制样吸取经预处理后样品 25l 与 25l 上样缓冲液混合均匀后，于沸水煮 3-5min 去掉亚稳态聚合，冷却后 4000rpm 离心 4min。5. 上样浓缩胶凝结后，向上槽内倒入适量电泳缓冲液，拔出样梳（要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果） ，向每孔内加样 10l（加样时移液枪要始
9、终竖直，且加样迅速，为避免边缘效应，最好选取中部孔注样） 。6. 跑胶加样完成后，在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，连接好冷凝水，接通电源，进行电泳，稳压 90V，电泳 90min 左右，进入分离胶后，电压改为 120V，待溴酚蓝距凝胶边缘约5mm 时，停止电泳。7. 凝胶板剥离与固定电泳结束后，取开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内（剥胶时要小心，将凝胶保持完好） ，用蒸馏水小心清洗 1-3 次，加入固定液进行固定 40-60min，倒出固定液，蒸馏水清洗 3-5 次。8. 染色固定清洗结束后，倒入染色液，染色 40-60min。9. 脱色染色结束后，蒸馏水清洗 3-5 次，倒入脱色液进行脱色，30-60min 后更换 1 次脱色液后，脱色至蛋白条带清晰即可。10.清洗电泳结束后，将电泳玻璃版及烧杯仔细清洗，并用蒸馏水进行漂洗后，将电泳所用物品归置原位。
