1、液相色谱柱的选择和方法开发,天津博纳艾杰尔科技/Agela Technologies （US）,内容概要,色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发 制备液相 混合固定相-优化复杂样品分离的一个新策略 如何改善强水溶性化合物的保留和分离,色谱基本概念回顾,色谱（chromatography）,色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）,幻灯片制作：WSY18,分离度,Rs - ResolutionN Theor
2、etical Plate Number Selectivityk Retention Factor 拖尾,幻灯片制作：WSY18,1.Separation of Compounds A and B,灵敏度,：Limit of Detection ：Limit of Quantification 柱效峰形（拖尾因子）,重现性,分离度（） 保留时间（，）选择性（ ）柱效 （） 灵敏度,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度 - 选择性 键合类型，基质表面特性；流动相、温度- 柱效 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速 峰对称性 基质表面特性
3、，键合类型，流动相，温度 保留体积 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 灵敏度 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性 基质表面特性，键合类型；流动相，温度流动相 pH，缓冲盐种类，溶剂；,影响色谱柱性能的主要因素,1、 色谱柱的构型色谱柱内径色谱柱长度2、 固定相柱填料粒径比表面积孔径孔隙率基质表面特性：- 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量- 耐碱性键合类型- 官能团、是否封尾- 键合相的保留行为、耐酸性,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100
4、mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0m，3.5m 普通快速分析5.0m
5、 常规分析,颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II,由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件：
6、 C8色谱柱，4.6150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中； 20min梯度，10 30%B；60C， 1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6
7、mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流动相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 温度： 35 检测波长： 230 nm 进样量： 20 L,硅胶纯度金属含量,硅胶基质类型及发展史,Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响,残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表
8、面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾 键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。 缺点： 不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应） 在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟
9、基pH=5.2， 普通硅羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖 重现性更好表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖 极性化合物保留和分离更好,键性化合物峰形对比,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 o
10、C Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped, ),C18 (non-endcapped, twin-layer,ASB C18,Zorbax SB C18,Saponins Extract,4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰代表产品： Venusil MP C18，Venusil ASB C18，Venusil HILIC,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,Agela Venu
11、sil ASB C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用，Durashell，Gemini C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定（Zorbax SB，Venusil ASB） 极性官能团嵌合反相固定相 ( Zorbax Bonus RP, Venusil HLP),固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱：保
12、留值随含碳量的增加而增加比表面积越大，保留值越大键合碳链越长，保留越大 C18 C8C3C1，长链之间差别不大,反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖尾峰,T0（尿嘧啶）,P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 键合相的稳定性,键合相的稳定性低pH值，键合相流失高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现,键合类型对键合相稳定性影响,低pH值，键合相流失,键合类
13、型对键合相稳定性影响（II）,空间位阻保护，延缓键合相流失,空间位阻键合代表产品： Venusil ASB C18 Zorbax SB C18,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,高pH值，硅胶基质溶解,pH9时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高pH值水解,表面碳杂化 Agela Durashell RP Phenomenex Gemini,杂化颗粒： Waters Xterra,表面碳杂化示意图,pH=12 条件下的稳定性,4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x
14、150 mm, 5um,1h,200 h,总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件,了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性 了解色谱柱的性质 粒径，孔径，比表面积 保留强度和柱效；抗污染性 基质表面特性，键合类型保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性 选择相应的色谱条件,色谱柱选择 （）,替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似 新方法开发： 粒径：2um vs 3um vs 5um （分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命） 内径柱长：内径3mm vs 4.6 vs 7.8（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关 比表面：（低比表面耐污染，
15、高比表面利于分离） 孔径： 在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶；）当流动相尽可能使用表面杂化；）使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留 键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的（）可以作为首选尝试；耐酸：选择；耐碱：Durashell 封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保留，降低柱流失。,乙腈水,乙腈水,乙腈水,KH2PO4 pH=4.2,混合固定相-优化复杂样品分离的一个新策略,混合固定相的意义,系统化的改变选择性，便于优化分离度；使难以在同一固定相上分析的强
16、极性和非极性化合物得以解决 降低离子交换柱的保留强度，降低缓冲盐浓度，从而使离子交换柱可以与质谱检测器相匹配,混合相比例与保留时间曲线,a,b,c,色谱条件 ACN : 50 mM KH2PO4 = 30:70; 1.5ml/min; 240 nm; 5 um, 300 A; 4.6250; 2 ul; Room temp.; 样品： Phenol and melamine,通过混合柱改善分离度,SCX,SCX : ASB C8 = 9 : 1 (B0014),HPLC conditions： ACN : 50 mM KH2PO4 = 30 : 70; 1.5 ml/min; 35 ; 20
17、uL; Melamine: 2 ppm; column: 4.6 250 mm;,降低缓冲盐浓度（倍）以用于,Sample Melamine (100ppm) LC Conditions 1 ACN : 50 mM KH2PO4 = 30 : 70;1.5ml/min; 240nm; 5ul; 5um, 300A, 4.6250mm LC Conditions 2 ACN : 10 mM KH2PO4 = 80 : 20;1.5ml/min; 240nm; 5ul; 5um, 300A, 4.6250mm Fig. a was tested under conditions 1 Fig. b
18、and c were tested under conditions 2,a,b,c,SPE proceduresFig. a LC ConditionColumn:Venusil AS-T C18 (SCX/C18）2.1 150mm; 5 um, 300 Mobile Phase：ACN : Buffer = 50:50; Buffer:10mM NH4Ac, HAc adjust pH to 3.0240nm, 0.2ml/min, 10 ul Mass ConditionESI，5KV; Capillary Temp 300,Capillary Voltage 15V; N2 Flow
19、 35 arb; Positive ion detectionScan mode: TIC (MS), TIC (MS/MS); Range (m/z) 50140,a,标准曲线,Precision: RSD=2.83% (n=5) Reproducibility：RSD=4.45% (n=5) LOD: 0.002ug/mL LOQ: 0.01ug/mL Recovery: 89.7% RSD=7.3% (n=9),空白样品,三聚氰胺标准品,三聚氰胺添加样品,如何改善强水溶性化合物 的保留和分离,改进水溶性化合物的保留和分离,使用极性反相色谱柱，高水相流动相；调整pH值抑制分析物的离子化。
20、使用离子对试剂，选择低比表面、短链键合相 使用HILIC分离技术 使用离子交换/反相混合固定相,2，-0-甲基-腺嘌呤核苷HPLC方法,RT样品峰=18.902min RT主杂质峰=21.024min 主峰与后杂峰 （RT=20.634min）的分离度R=7.81, 主峰后杂峰（RT=20.634min）与主要杂质的分离度R=1.70,色谱柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm; 波 长：260nm; 柱 温：30; 流 速：1.0mL/min 流动相：流动相A：0.63g甲酸铵溶解于900ml水中，并用甲酸调PH=3.00，再加水使溶液为1L,过滤即得； 流动相B：乙腈 样 品
21、：流动相A溶解，待分离样品1mg/mL；进 样：5ul 梯度表：,阿奇霉素有关物质检测,空白,药典方法,样品，100%水,次黄嘌呤有关物质分析,色谱柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm 流动相：0.1%磷酸氢二钠溶液（磷酸调节pH值至7.50） 流 速：1.0ml/min 柱 温：室温 波 长：254nm 样 品：样品2.0mg/ml（水溶解），对照品0.2408mg/ml（客户原液） 进 样：5ul,Venusil HILIC (丙酰胺键合相）,键合相，原理和目的,丙酰胺键合硅胶 已腈水流动相中主要依靠氢键合和电子极化作用，对于多羟基，多氨基，酰胺类和有机酸有很好的保留和分离
22、 在弱极性流动相中，对于极性化合物的保留与相似或略低，有利于极性化合物的洗脱 水溶液中稳定性明显优于氨基柱或纯硅胶柱,正相条件下与氨基柱比较,Test in Traditional Normal Phase Mode Columns: 5um, 4.6 x 150 mm Mobile phase: Chloroethane/methanol/water=91.8:8:0.2 Sample: Toluene, Nitrobenzene, 4- Bromoaniline acetate, 3-nitroaniline,Unisol Amide less polar,Venusil NH2, 分离模
23、式,N-aceto uracil,uracil,Column: Venusil Silica, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature: ambient Detection: UV 254 nm,分离模式,N-aceto uracil,uracil,Column: Venusil HILIC, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature:
24、 ambient Detection: UV 254 nm,Venusil HILIC (丙酰胺固定相）,N-aceto uracil,Ganciclovir,Ganciclovir,Column: Venusil Hilic, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature: ambient Detection: UV 254 nm,水溶性维生素分离,Time,Samples: VB1, VB6, VC, VB2 HPLC Conditions Column: Venu
25、sil HILIC 4.6 x 150 mm, 5um Mobile Phase：0.1%TFA:ACN = 90:10 Det: 280nm; Flow: 1.0mL/min; Temp: 30； Inj: 2 L, Column, 5m, 4.6mm150mm Part No.: 951505-0,Brand P , NH2 Column, 5m, 4.6150mm,Brand W Silica Column, 5m, 4.6150mm,Mobile Phase:A: 0.1% TFA in Water ；B: 0.1% TFA in AcetonitrileA:B = 90:10 Flo
26、w Rate: 1 mL/min Temperature: 30 Detection: UV280 nm Sample: VB1+VB6+VC+VB2,选择性比较,VB1+VB6+VC+VB2,VC+VB6+VB1+VB2,VB1+VB6+VB2+VC,稳定性比较 (aging: pH=7, 20 mM phosphate buffer/MeOH=40/60; 100h),100h,Venusil HILIC,silica,VB1,VB2,VB1,VC,VB2,VB1,VC,VB6,VB2,VB1,VB2,VB6,VB1,VB2,VB1,VB2,35 h,100h,NH2,Decitabine
27、 and Impurity Analysis,Venusil HILIC 4.6150mm，5m，ACN： H2O964，1ml/min， UV244nm，room temp.,Analysis of Acarbose and Impurity,ACN : KH2PO4(4.4 mmol/L) -Na2HPO4(2.0 mmol/L) = 70 : 30; 1.5 ml/min; 35 ; 210 nm; Venusil HILIC，5 um，100 ，4.6 150 mm,Separation of Shikimic Acid (3,4,5, trihydroxy-1-cyclohexene
28、-1-carboxylic acid,Venusil HILIC 4.6 x 250 mm, 5um; ACN/1% formic acid 90-60% in 20 min, ambient temperature, 1mL/min, UV210 nm,Comparison: Validamycin,Atlantis-C18( AQ), 4.6 x 250 mm, TFA 1%,Venusil HILIC , 4.6 x 250 mm, ACN/water 85-40% in 30 min, UV 210nm,博纳艾杰尔科技及其产品介绍 汪群杰,Who is America-gel-Asia
29、 Technologies?,2004成立于美国特拉华州，开发和生产液相色谱填料和色谱柱 2005年成立北京艾杰尔科技有限公司，负责艾杰尔科技产品的中国和亚洲市场开发 2007年在天津滨海新区成立博纳艾杰尔科技有限公司，投资近2000万，建立中国最大色谱分离材料研发和生产基地；产品扩充到5大类，上千个规格 2008销售额3400万；2009年目标5000万；,核心业务,分离材料,固相萃取,解决方案,固相萃取和色谱 分离纯化设备,创新成就梦想!,全球最大色谱柱研发团队之一：归国博士4名；硕士12名，本科11名 开发色谱相关设备和材料5大类（液相色谱柱、固相萃取柱、快速纯化柱、全自动制备色谱仪、固
30、相萃取仪），近百个系列，上千个规格的商业化产品；申报专利11个（其中2个已获授权） 2006年10月成功主标科技部十一五重大支撑项目项目中的课题四“高性能色谱填料和色谱柱的研制”；成功参标科技部十一五重大项目科研试剂项目中“固相萃取材料的研制与开发” 入围天津市2009年15个自主创新重大专项,不断完善的质量保证体系,充分的技术投入以打造坚实的技术基础 质量方针：质量第一、全员参与；满足客户，不断进取 全方位质量控制体系：研发、原材料供应、生产工艺、质量检验、跟踪/反馈2007年10月成功获得ISO9001质量认证 - 2007年分别通过美国第一大和 第二大集成供货商THERMO Fisher
31、 和VWR公司的现场考核,全球一体化的研发、生产、销售和服务,公司分布： Newark, Delaware, USA：研发和销售中心 天津：2600m2 研发、生产和物流中心 国内办事处：北京、上海、广州、杭州、南京、济南、郑州、沈阳 全球销售渠道和客户：- 26 代理商遍布全球五大洲，包括美国、加拿大、日本、法国、德国、印度、韩国、泰国、巴西、南非等。- VWR （全球第二大实验室设备和耗材供应商）的6大色谱产品供应商之一- 全球客户包括著名仪器厂家Thermo；著名制药企业 默克（默沙东）、莉莱、Amgen、Sanofi、Shering-Plough； 著名制药技术服务公司 考文斯、Xen
32、oBiotek、QPS、Frontage Labs。,客户评价Merck,“the ASB C18 column outperformed any other column I could get my hands on and I was able to handle the hundreds of COMT compounds I was presented with. ”McClain Ray T., Ph.D Merck & Co., Inc Friday, March 20, 2009,客户评价Covance,“I tested for my compound and found a
33、 better Sensitivity for ASB C18 column than regular luna C18 2.150 mm, 5um. ”Xiaorong Liang, Ph.D Staff Scientist Covance Laboratories Inc. Thu, Mar 19, 2009,从样品前处理到分析、制备的全线产品,中压制备系统及制备柱,CHEETAH,FS-1,2010年即将建成的研发生产基地,博纳艾杰尔色谱柱关键技术和系列产品介绍,关键技术,硅胶基质制备和表面改性技术：- UNISOL硅羟基取活技术- 表面杂化技术 键合技术和独特固定相：- 成熟可控的横向
34、交联键合工艺，大位阻硅烷键合工艺，混合键合工艺，手性柱表面涂敷工艺- MP-C18； ASB系列；Durashell系列；丙酰胺 （Venusil HILIC）；XBP-C18 （2）；手性柱 色谱柱装填技术：- 各类固定相（反相、正相、离子交换）；尺寸（2.1x30-50x300mm）- 混合固定相装填技术,主要色谱柱产品,尺寸规格：快速分析柱、分析柱、制备柱 固定相 - 反相- 正相- HILIC系列- 离子交换- 混合固定相（Optimix）- 体积排阻- 高聚物,与多层结构相关的新型固定相,Unisol C18: Venusil ASB C18, Unisol Amide: Duras
35、hell RP,Agela Unisol C18,具有高度适用性的反相色谱柱 极性化合物保持良好的对称峰形 LC-MS极高的灵敏度 显著增强的对极性化合物的保留和分离能力 100% 水流动相兼容 对生物基质的耐受性 宽pH范围(1.5-9.0),碱性化合物优良的对称峰形,1. Uracil 2. Pyridine 3. Butylparaben 4. Naphthalene 5. Acenaphthene 6. Amitriptyline,Column: Unisol C18, 4.6 x 150 mm, 5u Mobile phase： MeOH：NaH2PO4/ Na2H PO4 （PH
36、7.0）=70：30 Temp.： 30 Detection： 254 nm Injection： 10 L,TF= 1.09 Plate= 12046,对极性化合物显著增强的保留和分离能力,Fresh Column; Plates:3224,After column washing and re-equilibrium in 100% water (0.1% formic acid); Plates:3045,After 500 sample injections; Plates:2810,Sample: uridine of calf blood plasm (dilute 20 time
37、s with 0.1% formic acid) Injection: 1uL Column: Unisol C18 2.150mm,5m Flow:0.3mL/min Mobile phase: 0.1% formic acid solution (100% aqueous phase) Injection frequency：500 /8min, After 500 injection, wash with methanol /0.1% formic acid solution =50/50 for 30mins，column temperature 40 ; rinse with 95%
38、MeOH for 30mins, column temperature 45 ,良好的生物基质耐受性,Venusil ASB-C18,极性 C18 pH 范围 0.8-7.0 ( pH=1, 100oC下仍稳定) 无封尾 C18, 150 A, 200 m2/g (compared to Zorbax 80A, 180m2/g) 硅羟基 pH=5.2 (compared to Zorbax pH=3.5) 100% 水流动相兼容 (compared to Zobax SB, non-compatible) LC-MS 高灵敏度 : 比多数C18固定相高2-3 倍(low bleed, iner
39、t surface and high efficiency),碱性化合物显著改善的峰形,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped,
40、 ),C18 (non-endcapped, twin-layer,Agela Venusil ASB C18, 2.150mm, 5m,Aglent Zorbax XDB C18, 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,LC-MS 灵敏度比较,0.01 ng/mL 伪麻黄碱,Best S/N: X2-3 sensitivity comparing to other columns,Unisol Amide - 一种新型 亲水正相色谱柱,硅胶基质的新型酰胺键合色谱柱： 1- 对水溶性化合物更强的保留和分离能力 2- 比硅胶柱和氨基柱具有更好的稳定性,Durashell RP,独特的键合结构 pH 范围 1-12 良好的表面惰性 超高载样量,pH=10,Durashell RP 5um, 4.6 x 150 mm Methanol: aqueous ammonia（pH = 10）= 65:35; 1.0 ml/min; 254 nm; 30 ; 5 uL,1- Uracil 2- Pyridine 3- Paraben 4- Propanolol 5- Naphthalene 6- Acenaphthene 7- Amitriptyline,
