1、单个核细胞的分离,实验目的,1熟悉免疫细胞分离的常用方法。2掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。,免疫系统,免疫器官免疫细胞免疫分子,外周血细胞成分,淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 红细胞和血小板,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 血小板：1.0301.035,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同,人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中常用的
2、细胞群。,【实验原理】人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.0751.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque 比重 1.0770.001 ）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。,Ficoll分层液,聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll ,其密度为1.0770.001。主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。其主要成分:2份浓度为6、密度为1.020 g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll )与1份浓度为34、密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶
3、液混合。,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,密度梯度离心(Ficoll)离心,试剂与器材,1.标本 外周静脉血加EDTA-K2抗凝，或1000U/ml肝素抗凝血。 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重(1.0770.001）有商品供应。 3.Hanks液 4.台盼蓝染液 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。,操作方法,1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。2.取1.5ml Ficoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：
4、2），二者之间有一明显的界面。,3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层,4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r /min 5min离心去血浆， 加 1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上清液。,5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。,100%,单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液ml每毫升
5、单个核细胞数 全血ml数全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数1毫升细胞悬液) 4个大方格内细胞总数 10 1032(稀释倍数) 4,6.细胞活力检测,取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞数,结果判断,活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在95%以上。,实验讨论,1. 注意事项将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。,分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以1.0770.001为好；小鼠为1.088,而马则为1.090。 配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性,方法评价,密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法， 用该方法不能除去其中的单核细胞。,临床意义,分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。,
