1、 能够开发一个新方法对于 HPLC 的初学者来说有很大吸引力，但是新手往往会感觉无法下手，其实完全不是那么一回事，只要你有一台双泵或者四元泵的 HPLC，看了本文，就可以上手去做了。 首先我们要保证的一个根本原则是： 我们要做出来的是一个有 稳定，明显 的 分离 ，并且 在检测器的响应明显，有定量理论基础的方法 。 这句话中的 “稳定 ”、 “明显 ”是必要条件，有一点不达标方法就没意义。 然后，对于新手来说，最好遵守这样一个小原则：我们从不新建，我们只是套用。 你已经接触到或看到的 HPLC 检测条件， 反相的条件下，有机相不外乎甲醇乙腈， 水相稍微复杂点，但也就是那么几套缓冲液或酸的体系。
2、那么我们建立方法时候如何选择它们呢？它们都有什么区别呢？听我一一道来。 先讲有机相，选择甲醇或是乙腈？在一般条件下，我给你这样的建议：你平时用甲醇多，就用甲醇的条件；平时用乙腈多，就用乙腈的条件。建立的方法，少不得自己要用，当然是自己越方便越好。如果能使用和其他常做的样品一样或相似的条件，会省下很多工作量和时间。 甲醇和乙腈是的主要区别，就是乙腈价格贵，毒性大，但是洗脱能力强 通俗点讲 ，就是把柱子里面的样 品冲出来的能力比甲醇高，比如 50%的甲醇水和 35%的乙腈水做同样的样品出峰时间可能差不多，当然，有的样品也许出现相反的情况，我们只讲大多数。甲醇的特点就是便宜，毒性相对小，洗脱力差。还
3、有一个要注意的是，甲醇在低波长（低于 210nm）的检测条件下，一般是不用的。因为本身有紫外吸收，会让你的基线很难看 你不用紫外或 DAD 检测器？哦，当我没说。至于甲醇是质子体，乙腈不是的话题，我们不展开说原理和区别了，一般来说知道有这回事就好，那就是有时用乙腈分不开或峰型难看的样品，换了甲醇会好很多，这样的样品并不多见，大多数 时候水相会承担甲醇的这个作用。 水相的体系选择要复杂点，一般常见的 酸性体系有磷酸，甲酸，乙酸，三氟乙酸，高氯酸等， 由于现在的色谱柱绝大部分都是硅胶填的，碱性的液体会跟硅胶起作用，所以碱性的流动相体系不常用，很特别的色谱柱广告宣传可以在 pH=12 下使用，那是针
4、对特别的样品了。 缓冲盐体系有磷酸缓冲盐体系，三乙胺缓冲体系（一般用乙酸或磷酸调整其 pH），乙酸铵缓冲体系等 。其他的就是离子对试剂， X 烷磺酸纳，四丁基 X 铵之类，也算他们是缓冲盐吧。注意，缓冲盐的适用波长参照其对应的酸，另外， 缓冲盐一般都不适用于 液质联用和蒸发光散射检测器 。 下面是重点内容了，先声明，我介绍的是自己的经验，有大方向不对的请多指正，但是化学品结构千变万化，有个性的样品也不是没有，不可能有个统一的理论适用于所有样品，因此个案我就抛在一边，你运气不好遇到了无非多试几个流动相体系而已，不要跑来找我算账，说我文章里怎么怎么说了，你听了我的话浪费感情的话，我不承担责任的。
5、什么情况下用酸，用什么酸？ 回答： 对于有酸碱性的样品，酸都是很好的选择 。选择的原则就是，保证 pKa 和流动相内的 pH 相差 2 以上（我们仪器信息网有个常见化 合物 PKa 数值表， pdf 文件，五星推荐）。忘记 pKa是什么东西的同学们，如果不想看书的话，我告诉你我的理解： 就是保证我们的酸比样品的酸性强很多或弱很多，如果样品是碱性，那么要比它对应的酸性强很多或弱很多，总之不和样品接近 （一般我们选择强于样品的酸性）。选择顺序是：按需求来，优先考虑有机酸，优先考虑腐蚀性小的酸。出来混的都不容易，能用安全的当然要用安全的。 希望下个表格能对你有所帮助。 什么情况下用缓冲盐？ 单独用酸
6、不行的时候用缓冲盐 。如果样品的粒子性不强，那单独靠 pH 的抑制不起作用的时候，需要加一些盐进去，进行其他方面的抑制。一般情况下，磷酸缓冲体系是首选，因为配制简单。有时我们也会用到三乙胺，但是现在它的出场几率越来越少。因为色谱柱的科技含量越来越高，绝大部分色谱柱都是封尾过的。所以曾经大受欢迎的扫尾剂三乙胺的作用越来越小。如果不考虑 pH 的影响，三乙胺大部分时候只能锦上添花，雪中送炭指望不上了 。就是说，如果峰型有点难看，但还是凑合，那么可以考虑加点进去改善一下；如果已经惨不忍睹，那就要考虑其他因素，三乙胺加了作用不大。 缓冲盐的选择原则是：越简单越稳定就越好。缓冲能力要强，如果受到一点影响
7、 pH 就会有明显变化，那保留时间就可能飘；配制要简单，需要调 pH 值的话也要有相应的酸或碱 。别问我为什么不用盐酸，我前面说过了，我们不新建，我们只是套用。为什么我们要冒风险去选择大多数人都不用的东西呢。另外，除非你手头有类似的结构采用离子对试剂的成熟方法，或者你有大量的 HPLC 使用经验（这样的话本文您就当娱乐看，多指 点指点俺的错误），否则一开始选离子对试剂是不明智的。离子对缓冲体系平衡时间长，做完样品后需要清洗的时间也长。我们只能是先易后难，至少可以先用常见的缓冲体系看看什么 pH 值下峰型相对最好看，然后再上离子对试剂。缓冲盐体系下，出峰太早，峰型很难看，两个相似结构的峰因为拖尾
8、或峰型太宽的原因不能分离，这样的情况下，离子对试剂是你可以期望的选择。 贴士：对于酸碱性不明显，但是结构式看起来体积比较大的样品，一般缓冲盐比较好。 面对如此多的选择，当然不能挨个实验下去，那样本文就没有意义了。那么先试哪个后试哪 个呢？我可以很负责的告诉你，第一选择应该是 水。废话，谁没事喜欢给自己找麻烦。然后能用单独的酸就用单独的酸，不能再上缓冲盐。最后考虑离子对的缓冲盐。 样品在色谱柱内的情况，我们可以打个比方，大家都看过电影节走红地毯的明星们吧，把色谱柱看成红地毯，然后一群明星（样品）要走过红地毯，地毯旁边会有一大群的记者和影迷，他们就是色谱柱的填料，假设治安状况不够好，明星都需要带着
9、保镖过地毯，保镖我们认为是推着样品前进的流动相，由举办电影节的我们雇佣使用。我们的目的，就是把不同影片的明星分开来，地毯旁的记者影迷（ 色谱柱填料），负责跟明星握手合影等，这样人气旺的行进速度就会慢，没人搭理的明星们就走的快，在地毯那头，我们的目的达到，明星们分开了。我要开始理论解释了（汗一个先），我们是电影节的组织者，我们要知道那些明星收了出场费但是人没来，所以必须点清明星的个数。在这个过程中，保镖（流动相）是我们雇佣的，有什么问题优先找他们，影迷（色谱柱）是其次可以下手的，明星（样品）我们得罪不起，一般不考虑改变他们来达到目的。就跟踢球踢不过人家，你可以买球员请教练，但是你不能换对手一样；
10、我们对样品没有选择权。给你什么你就得做什么。 合适的检测方法要保证： 第一，保镖不要对明星太客气，让他们一拥而上过去握手拍照，队形就会拉的很长很散，也许来自同一部影片的明星们都要被分成两队了，这严重影响我们数人头，所以不允许。（ 流动相的 pH 和 样品的 Pka 不能接近，否则会出现很难看的峰型，有时甚至出现分叉峰。） 第二，保镖们不要太凶悍，或者明星不要太冷门，这样两边的影迷记者没机会或没兴趣跟明星亲密接触，哗啦啦冲过去了，我们的目的没达到，不行。（选择的色谱柱的固定相要对样品有一定保留，不然样品一下过去，没有任何保留直接出峰，这样的条件是不可行的， 因为色谱柱没起到作用，样品里面的东西完
11、全没分离。） 这样的情况下，我们首选考虑换一批不那么凶的保镖（ 调整流动相的极性，或是降低有机相的比例一般可以改善出峰太早的情况 ）；还有些明星们心急一下子冲过去，这么不给面子的，一定要保镖拦着，保持队形通过（ 抑制扩散快的样品需要极性强于他的流动相 ，很多酸性稍强的有机酸，如果水相不加其他东西只是纯水，就会不出峰 因为混在人群中过去了你没看到 或出峰很快，选择比它强的酸是很常见的做法）；最后，我们不能怪明星们名气太低，人都是你请的啊，没办法，换一批对他们感冒的粉丝站两边吧 。（样品就那样，我们不能改变，如果你使用了你认为合适的流动相体系，样品还是在 2 分钟或更早就出来，那建议考虑换跟柱子。
12、有些极性特别明显的样品，氰基柱或氨基柱都是不错的选择，或者他们刚好有 CN 或 NH2 的基团，这样效果最明显） 第三，跟上面相反，明星太受欢迎，半天移动不了几步，这样我们要调整保镖，拉开旁边太狂热的粉丝们，冲过去。（保留时间太长， 出峰太慢的时候 ，别犹豫，不改变分离的情况下 加大有机相比例吧 ，出峰晚对柱效影响也很大） 第四， 某几个明星人气相差很小，影迷对他们的喜欢不相伯仲，于是合伙过地毯 不行 （某几个峰不能分离的情况。） 这种情况有以下几种解决方法，大家众所周知的， 降低有机相比例可以改变出峰时间 ，这是首选方法。需要补充一点的是，降低了有机相的比例， 只会使所有的峰都后移 我知道有
13、前移的，咱不说那个 但是如果本来分不开的两个峰，前峰的往后跑的多，后峰的往后跑的少，那么调整可能带来相反结果，两个离得更近了，这点要注意。改变缓冲盐的种类或加大缓冲盐的浓度有时也可以改变分离度 ，一般来说，这对于由峰型不好引起的分离不好作用明显一些。 其次，我们可以换一批更狂热的粉丝团 色谱柱。 狂热的粉丝们不比中庸的 C18，看到脸熟都要去握个手，他们喜好明显（对于有苯环，杂环的样品，苯基柱会比C18 好，有 CN， NH2 基团的样品，当然用对应的色谱柱了， C18 和 C8 的差别选择也可以根据这个来判断）。 记住，我不是一上来就推荐你用 C18 以外的柱子，能用 C18 这样常用的柱子
14、当然选择它了，不行才选其他的。 这里顺带简要介绍一下色谱柱。有位达人说， C18 柱的分离，其实就是样品水溶性差异的分离 。在大多数情况下，我认为这个道理成立。 C18 这么长的一个碳链，极性是非常小的，样品在流动相和色谱柱中间的分配，基本都取决于水溶性差异 。但是，现实情况是，在一根 C18 柱上不能分离的两个峰，换一跟完全分离了，还很漂亮，这跟理论不一样啊。按我理解，这是因为现代色谱柱的特点引起，各个品牌的 C18 柱都有各自的封尾技术，就是在闲置的 Si-OH 上面搞，有的是在他们上面连了个 CH3甲基，有的是异丙基，有的干脆把两个 Si-OH 脱一个水连起来，也有搞包被技术隔离 Si-
15、OH 的，这就使原本没极性的 C18 柱带上了 C1， C3 等等极性相对大很多的基团（好像还有上苯基的，非罗门好像有一款是 C1-C6 都加的有，还特别宣传过，不过不太确信，忘记了），这样一来，不同 C18 柱的分离差异相差就有了较大的区别。在某方面来说这是好事，但也会有其他的麻烦，新上的基团会对某些样品有特殊的分离作用，这个我们欢迎，但是新加上去基团的数量会严重影响样品的保留时间。你会看到有的色谱柱宣传他们对流动相比例的改变响应非常敏感，稍微改变比例就会引起分离度的较大差别，有的色谱柱则强调它们各个批次间的差异非常小，你知道原因了吧。对于开发检测条件，前者当然方便，对于长期固定方法检测，后
16、者要好，大家各取所需即可。 最后，前面两种情况都无法改变，或者你觉得换色谱柱很麻烦，那么我们还有大招 让明星们自带粉丝 团。这就是离子对试剂 。有些样品往往会出现峰型很怪，馒头，山坡等，这是因为保镖和明星们关系不错，限制太少，没有让排成一列横队前进，而是放任他们跑前跑后跟影迷握手（样品的电解平衡点跟流动相很接近，出现了两种形态，离子态和分子态），这跟前面有个情况很相似，正常情况下我们可以用加强保镖力度的方法解决（使流动相的 pH和样品的 PKa 相差 2 以上），但是遇到大牌明星，你管的太严，人家脸一黑，径直过了红地毯谁也不搭理，你没办法了吧（ pH 因为不能过 7，只能往小了调，改的太低，会
17、影响保留时间）。这个时候，只好请来明星们的铁杆粉丝团，簇拥他们过地毯，这样行进速度慢了下来，对外围的伪粉丝骂退，真粉丝或记者和里面铁杆都是熟人，大家该合影的合影，该打招呼的打招呼，保持了队形，还让不同的明星分离开来。问题解决。（离子对试剂和样品结合，然后色谱柱对其进行保留）这样做的坏处就是清场比较困难，明星都走半天了，铁杆还不愿意散去 你还是打落牙齿咽在肚子里面吧，谁让人家是大牌呢？（离子对试剂使用前，色谱柱需要稳定比较长的时间，运行后的清洗也需要比一般缓冲盐更长的时间，有的色谱柱宣传他们对离子对试剂稳定很快，可见他们是非常职业的记者粉丝团，为我们电影节 的组织人员提供了方便。） 上面举例为了
18、说明情况，是按照一般的色谱原理比喻的。其实我们常用的反相色谱，分离模式大多数时候刚好相反，也就是说，两边站的影迷不一定是来拍照合影，而是相当部分都拿着臭鸡蛋准备砸的，这个时候的分离不是看谁的人气高吸引力强出的晚，其实是看谁更不受欢迎谁就跑的更快。其实我觉得道理都一样，换个说法而已。 小贴士： 有时候峰型很不好的时候 ，不一定非得加离子对试剂，添加少许更强的有机试剂如 异丙醇，二氧六环等溶剂 ，会起到意想不到的效果，四氢呋喃也一样，但是要说明的是，这些东西不宜加的太多 ，尤其是二氧六环，整个体系内 0.1%就算比较多了。不过不推荐太新的新手这样。 看了上面，是不是觉得方法建立很简单，没什么技术含
19、量啊，其实，只要有柱子有试剂，样品在检测器有响应，我觉得怎么也能鼓捣出来几个峰，关键是建立出来的方法，要有效，要能反应一定的情况，然后自己要对新建立方法有了解。知道它在什么情况下合适。 先说定量方法，一般来说，有面积归一法（校正 /不校正）、外标法、内标法等。内标法在 HPLC 下适用条件不多，GC 因为进样的局限性用到的多，我就不说了，如果需要可以参照外标法。 如果你打算用面 积归一法定量，那你需要保证：样品里每个你感兴趣的杂质都有响应，样品和每个杂质都要分离，需要报告含量的每个杂质都要与其它峰分离。 一般如果不是客户给标准，我们要自己制订的话，那么你要保证关键的杂质的检出。不清楚关键杂质的
20、，我告诉你一般做法。假设样品最后一步的反应是 A+BC+D ， C 是样品， D 是副产物。那么应该制订 D 杂质的标准，然后可以考虑 A 和 B 中过量反应的那个，这样就给出两个杂质的标准了。一般情况下，对于纯度比较高的样品，不太会去考虑校正面积归一法。因为杂质太小，校正一下还不如修改标值方便。在某个杂质大于 5%以上的时候，可以考虑校正其含量值。校正因子的算法就是把该杂质和样品定量称量放在溶解在一起进样，然后根据面积和称量的质量计算。（有客户或其它资料直接告诉更好）。 制订好标准后，我们要对方法进行验证。整套的验证方法非常复杂，也不一定都要做。具体选择什么，我按照自己的经验慢慢来说。当然，
21、做的越多越保险 也越麻烦（不做最省事，哈哈）。其实有几点还是必须的，第一就是稳定性试验，样品配制好之后进样，然后过四个小时进样一次，不怕麻烦或有自动进样器可以每四个小时一次验证到二十四小时（我见过国外方法说明 72 小时稳定的 ），观察图谱变化，合适的方法应该保证主峰的面积相差不多，并且杂质没有增多或增大。样品在溶剂之中存放过程中可以会发生水解或其他反应，有时开发人员告诉你不太可能发生的反应，但是因为我们在配制时，样品在溶剂中的浓度非常低，也还是有发生的可能。一般情况下我们都选择了流动相做溶剂，如果有不稳定的情况发生，那么改变溶剂是第一选择。如果无法改变溶剂或改了也不行，那就要在方法里面声明，
22、告知这个样品配制好之后在几个小时内有效。样品需要避光、低温什么的，也要写清楚。 第二要确认一下分离度，你可以选择两个不容易分离又很重要的 杂质峰（或主峰），标记出来，然后规定他们的分离度在 1.5 以上。这一点在方法转移过程中是非常必要的。如果你的方法要给别人用，那么你在建立方法中很难分离的两个峰，有可能因为仪器系统（主要是色谱柱）方面的差异，应该分离的杂质未分离，这个时候你就必须给其他使用者提醒，避免发生不该发生的事。这个项目的验证一般是方法耐受度方面的验证，做起来很麻烦。 就是把pH、温度等会影响分离度的因素改变 20%，看看方法会发生什么影响。个人感觉是很脑残的验证项目，本来我们方法规定
23、了柱温、 pH 什么的就是让你按这个来做的，你改了条件受到什么 影响关我屁事。我们在建立方法的时候，如果试了几个体系或其他条件，对这些其实已经有印象了，五星级的推荐不做这个。就规定一下重要杂质的分离度就好。第三，其实不算正规的验证了，就是避免杂质和主峰合在一起没分离，但是你却不知道，或者样品里面还有峰没走出来，这个在建立方法的时候就要注意，有 DAD 检测器的可以用峰纯度看看，没有的话，最保险的方法是换个体系（最好换个性质差别比较大的色谱柱比如 C18 换成苯基柱）走一下看看有没有跟前面条件相比新多的杂质。没有更多色谱柱的，最简单的办法就是增大水相的比例进样，但是这样不保险。对 于可能没流出的
24、峰，可以考虑在样品主峰走完后慢慢的梯度增加有机相比例多走一会看看有没有新东西冲出。注意，比例加的太快，会有很多溶剂峰流。按照同样的梯度，走个空白做对照最好。 其他还有更严格的验证，比如验证每个杂质的线性等等，这个太复杂而且做法也很多，可以做到这一步的已经不需要看我的文章了，应该找些专业性文章或标准来看。 外标法定量需要保证：样品里要定量的峰必须和其他峰分离，要定量的峰响应要明显，并且有线性规律。一般常用的分外标一点法和标准曲线法。一点法，适用于样品含量有比较确定的范围（比如纯样品，就在 95%-99%之间），我们用已知含量的标样配成浓度一致的溶液进样，然后计算。曲线法适应于样品含量范围比较大（
25、比如回收某个东西的样品，含量可能在 5%-80%之间），这时我们用标样配制几个点，比如 1%， 5%， 10%， 40%， 80%， 100%六个样品，分别进样，做出曲线。有样品的时候，进样，然后代入曲线公式计算。曲线建立起来后，在一个系统上可以使用较长的时间，不放心的情况下可以在测试样品前，打一个已知标样看看，结果相差不多就可以一直用下去。特别要指出的是，外标一点法在有些检测器上是不好用的，比如蒸发光散射检测器，样品 的响应不是根据郎伯比尔定律，所以至少要 2 点定量。更多的检测器，要翻书解决，本文完全不能替代课本和专业书籍，特此声明，哈哈。 介绍完方法，然后就是如何选择的问题。这个其实是不
26、应该我们说了算的，要看实际的需求。一般情况下，还要继续往下进行化学反应的样品，如医药或其他产品的中间体等，会对杂质很敏感，这种情况下面积归一法用的多一点。因为样品内含的杂质也许会影响到后续的反应，引起催化剂中毒或其他不可预料的风险和损失，用面积归一法可以看到各个杂质的情况。而且面积归一法定量还有它最大的一个优点，那就是稳定。在保持色谱 系统一致的情况下，对于一个均匀的样品，面积归一法可以在不同的实验室得出极为相近的结果，所以尤其适合在一个企业的各个实验室之间使用。直接使用的样品，如农药或直接用来做制剂的成品药，用外标法的比较多，因为大家做出来后要使用的，所以需要的实际的质量含量（ w/w）。外标法反应的就是样品内的实际含量，而不像归一法只是根据面积得出来的纯度。其实现在更多的情况是两种方法都报告，所以最好能用一张色谱图出两个结果，把两种方法要注意的都照顾到。 我这里说的只是新建立方法简单的自己要做的定量和初步验证，真正的方法验证是一个很 严格的程序，建议参考我们的药典或是 FDA 等其他相关资料。上面举的例子只是为了说明问题，比如曲线点浓度的选择等等，不要简单的照搬，还是要按照需求来。验证方面的东西很多很复杂，各个机构公司要求也略有不同，希望大家把在工作过程中遇到的问题或感悟拿到我们仪器信息网来，我们一起讨论分享，共同提高。
