1、Primer Express TaqMan 引物探针设计 一、 安装软件 ABI 公司 Primer Express v3.0 Primers and Probe Design For Real-Time PCR 二、 Primers/Probes Design Guideline TaqMan Probe Primer Probe 与 Primer 的 距离 愈近愈好 , PCR产 物大小 建议 在 50-150 bp 为 最佳 G/C % 为 30-80 % 避免有 重复序列 的出 现 ，尤其避免 4 个 以上 G 的 出现 Tm 值 : 68-70 (Quantification ass
2、ay) Tm 值 : 58-60 65-67 (Allelic Discrimination assay) Probe 长 : Primer 长 : 1325 bases (TaqMan MGB probe) 20 bases (Optimal) 1330 bases (TaqMan probe) 避免 连续 6 个 A 的 序列出现 3端的前 5 个序列里不 能超 过 2个 C+G 5端第一 个 序 列不 能 为 G (如果 选择 FAM-dye 在 5端第二 个序列也可以为 G) 选择 C 比 G 多的 strand 当 作 probe b 避免 3端的前 4个序列 含 有 3 个 或 以
3、上 G (GGG-MGB-3 or GGAG-MGB-3) a 避免 probe 的 中间区域 含有 2 个 或以上的 CC di-nucleotidesa a. 针对 TaqMan MGB 探针 b. 参数可选择设定 三、 Primers & Probes（ Automatically Design） 进 入 Primer Express 3.0 软件 File New 选择 TaqMan MGB Quantification 或 TaqMan Quantification OK Tools 按 Add DNA File， 寻 找序 存取位置，按下 Add，将 序 档案加入空白文件。亦 可在
4、Sequence 的 界面 中使用 Copy & Paste 复制和粘贴 或直接 输入 序 。 * Primer Express Software 只能接受 dan, txt, ab1,或 abi 的 档案 格式 ， 请 事先 将 欲 分析的序 存成纯文字档即 可 ( 序 是从 database download 下 来时 ,请 刪除 与 序 无关的资料 )。 可勾 选 Double Strand, 即 会显示 double stranded DNA sequence。 各 Tools 选项操作 1. Exclude: 必要的序 可 用 Exclude Selected Bases 将序列划掉
5、。 - 先 选取 要的序 范围，点选 “Exclude” ，即可看 见 此 区域 被 划掉。 2. Junction: 如果 已经 知道序 上 junction 位置 则 可 用 Junction - 选取 juction 的位置 (必须 含 2 bases)，再 点选 Junction，即可看 见 此区域 被 红 色 标记 起 来 。 3. 在 Parameters 界面 中可看到 Primer/Probe Tm 值 设定 及其他 Primers/Probe 情况。 4. 回到 Sequence 界面 ， Tools Find Primers/Probes ， 软件 即 开始 找 寻找适当
6、的 Primers/Probe pairs。 *Primer Express 软件会 找到 Candidate Primers & Probe pairs，一次 search 最多能找到 50 种 组 合，这 些 组 合 与 Primers / Probes 界面 中。 中间 Location 说明 primers & probes 在序 中的相对位置，在 横线 上方的 数 字代表起始位置，橫 线 下方 则 代表 终 止位置。 Sequence 界面 中 会显示出与 Primers / Probes 界面 相 对应 的一 对 Primers/Probe: 粉 红 色片段是Probe 的位置，
7、蓝 色代表 Forward Primer， 黄 色片段 则为 Reverse Primer，如下 图 所示。 (*但 并 表示此 为最佳的设计 )。 在 Primers / Probes 界面 中 会将 每 对 Primers/Probe 的 组 合 出来，请从中挑选出适当的组合，挑选 方式可 依据之前的 primer/ probe design guideline。在 MGB Probe 的 筛选 中 , 亦在 Parameters界面 中加 选 C 比 G 多的序 作为进一步筛选的参数 。 決定 primer/probe set 之 后则 可 进行存档 ，存档的方式从 File Save As 存档 。如果想 将 所 选择的 primer/probe set 单独储存 , 可 用 ExportOrder Info 的方式，或者 要储存 50 个 Primers /Probes 清 单 ，可 点选 ExportPrimers/Probes List ，以上 两种方式 可存成 txt 档案 ，在 Excel中 开启 。
